干扰人ITGB5基因表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响

摘要

目的:
　　通过干扰瘢痕相关基因整合素蛋白β5（β5-Integrin，ITGB5）的表达，观察该基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid Fibroblast，KFb)的细胞周期、增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响，阐明ITGB5基因在瘢痕疙瘩形成及发展中的相关作用，以期为瘢痕疙瘩的发病机制研究提供理论依据、为临床探寻瘢痕疙瘩的治疗靶点研究提供先期实验工作。
　　方法:
　　1.构建干扰人ITGB5基因表达慢病毒载体(lentiviral vector, LV);
　　2.将培养好的瘢痕疙瘩成纤维细胞随机分为三组，分别为ITGB5干扰慢病毒载体感染瘢痕疙瘩成纤维细胞组(LV-KFb)，空载病毒感染瘢痕疙瘩成纤维细胞组（LV-NC）及空白对照组(KFb)，用慢病毒持续感染LV-KFb组及LV-NC组细胞，流式细胞仪筛选稳定细胞株;
　　3.Real-time PCR及Westem Blot检测慢病毒载体感染后各组细胞中ITGB5基因及蛋白的表达情况;
　　4.MTT法检测慢病毒载体感染后各组细胞的增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况;Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力变化;
　　5.利用免疫共沉淀技术检测转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)及ITGB5间的相互作用。
　　结果:
　　1.干扰人ITGB5慢病毒载体可以成功感染KFb，且在MOI=50时细胞感染率可达80％，通过FCM可获得稳转细胞株;
　　2.慢病毒感染KFb后，KFb组、LV-NC组及LV-KFb组中ITGB5 mRNA及蛋白的表达量分别为1.00±0.00、1.08±0.05及0.34±0.01和0.91±0.03、0.93±0.02及0.28±0.07，与LV-NC组及KFb组比较，LV-KFb组中ITGB5 mRNA及蛋白的表达量均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);
　　3.慢病毒感染KFb后，各组间细胞的增殖情况在接种后24h无显著差异，48h后，LV-KFb组的增殖较其它两组明显变慢(P＜0.01);
　　4.慢病毒感染KFb后，KFb组、LV-NC组和LV-KFb组早期凋亡细胞所占百分比分别为5.94±0.28、6.08±0.35、13.81±0.46，晚期凋亡细胞所占百分比分别为18.75±0.93、13.36±1.35、31.30±1.67，LV-KFb组较其它两组早期凋亡及晚期凋亡细胞数明显增多，差异有统计学意义(P＜0.01);
　　5.慢病毒感染KFb后，KFb组、LV-NC组和LV-KFb组S期细胞所占百分比分别为34.86±1.86、34.03±2.14、20.03±1.32，LV-KFb组较其它两组S期细胞所占比例明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01);
　　6.慢病毒感染KFb后， LV-KFb组的穿膜细胞数在迁移及侵袭实验中均明显少于其它两组，差异有统计学意义(P＜0.01);
　　7.ITGB5及TGF-β的阳性条带在免疫共沉淀中均能被检测到。
　　结论:
　　1.成功构建了干扰人ITGB5基因表达慢病毒载体;
　　2.成功获得了慢病毒感染KFb的稳转细胞株;
　　3.干扰人ITGB5慢病毒能够成功感染KFb并能有效抑制细胞中ITGB5mRNA和蛋白的表达;
　　4.ITGB5能够促进KFb的细胞分裂、增殖、迁移和侵袭能力，抑制KFb的凋亡;
　　5.ITGB5对KFb的作用可能通过TGF-β信号通路实现;
　　6.ITGB5可做为瘢痕疙瘩基因治疗的重要靶点之一。

目录

声明

摘要

实验仪器及主要试剂

前言

第一部分 干扰人ITGB5 RNAi慢病毒载体的构建

实验一、ITGB5 RNAi慢病毒克隆的制备

一、实验方法

二、实验结果

实验二、ITGB5 RNAi慢病毒包装

一、实验方法

二、实验结果

第二部分 干扰人ITGB5慢病毒载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞ITGB5基因表达的影响

试验方法

实验结果

第三部分 干扰人ITGB5慢病毒载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能影响

实验方法

实验结果

讨论

结论

文献综述 MAPK信号通路与病理性瘢痕相关性的研究进展

参考文献

附录

攻读博士期间发表文章及获得奖项

致谢