miR-206/133b通过调控M2型巨噬细胞分化和CD47表达抑制结直肠癌进展的作用与机制研究

摘要

背景:
　　结直肠癌是全球范围内一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在世界范围内逐年增高，流行病学证据表明全球每年结直肠癌诊断率在男性中位于第三，女性中位于第二。其中，中国结直肠癌的发病率和死亡率也均呈上升趋势，2015年新发例数为37.6万，死亡例数为19.1万。目前认为结直肠癌的发病与遗传和环境（如饮食）等多种致病因素有关，是基因-环境共同作用的结果，然而关于结直肠癌的确切病因与机制仍有待进一步明确。
　　MicroRNAs(miRNA)是内源性非编码的单链小RNAs分子，长度约18-25个核苷酸，其广泛分布于真核生物中。研究表明，许多miRNA基因位于与疾病相关的基因位点的附近，而且在肿瘤发生过程中有差异表达，这些研究表明miRNA参与调控肿瘤发生、进展，具有抑癌基因或原癌基因功能。文献报道癌组织与癌旁组织的miRNAs表达谱具有显著差异，这种差异与肿瘤的发生进展关系尚不明确。我们前期的芯片数据表明，相比于癌旁组织，miR-206/133b在结直肠癌中均低表达，而它与结直肠癌的关系国内外尚未有报道。对miR-206/133b的研究表明，其在巨噬细胞、炎症和肿瘤的研究中发挥着重要的作用。
　　在实体肿瘤微环境的作用下，单核细胞进入肿瘤组织，分化形成特定表型的巨噬细胞，即为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)，分为M1亚型和M2亚型。在肿瘤早期，TAMs以M1亚型为主，发挥杀伤肿瘤细胞的作用;然在肿瘤晚期，TAMs则以M2亚型为主，发挥促进肿瘤增殖、侵袭和转移的作用。我们的前期研究表明miR-206/133b可以促进M2型巨噬细胞向M1转化，抑制结直肠癌细胞的增殖转移。因此我们从体内外实验、临床标本、分子方面探讨miR-206/133b对结直肠癌的抑制作用与分子机制。
　　目的:
　　1、评价结直肠癌标本中miR-206/133b指标的表达水平及其与临床指标的关系;
　　2、体内外实验研究miR-206/133b抑制结直肠癌进展的作用;
　　3、探讨miR-206/133b抑制结直肠癌进展的分子机制;
　　方法:
　　1、Taqman qPCR检测临床标本中miR-206/133b表达水平，统计学方法分析miR-206/133b表达水平与结直肠癌临床与预后的关系。
　　2、分别建立结直肠癌细胞系HCT116和SW480过表达miR-206/133b细胞模型，通过细胞克隆实验、增殖实验、划痕、迁移、侵袭实验检测miR-206/133b过表达后的影响;通过流式细胞技术检测miR-206/133b过表达对细胞凋亡与周期的影响。
　　3、建立THP-1细胞分化巨噬细胞M1和M2亚型模型;于M2亚型，过表达miR-206/133b，检测M2亚型表达水平的变化;并收集上清培养液，离心过滤后，按照1∶1比例加入结直肠癌细胞中，通过细胞克隆实验、增殖实验、划痕、迁移、侵袭实验检测miR-206/133b过表达后M2巨噬细胞对结直肠癌细胞的影响。
　　4、采用生物信息学预测并筛选确定负性调控因子YY1是调控miR-206/133b表达的转录因子;SYBR qPCR和Taqman qPCR分别检测过表达YY1后YY1和miR-206/133b表达;构建Luciferase荧光素酶报告基因系统，并检测YY1作用于miR-206/133b启动区的荧光素酶活性;
　　5、生物信息学预测CD47可能是miR-206/133b的靶基因;通过Luciferase双荧光素酶报告基因系统确定miR-206/133b与CD47靶基因mRNA的结合位点;最后通过qRT-PCR和Western Blot进行验证miR-206对CD47表达的抑制。
　　结果:
　　1、miR-206和miR-133b在结直肠癌组织中的表达及与临床特征的关系
　　与癌旁相比，miR-206和miR-133b在结直肠癌组织中表达均下降。Pearson x2检验结果表明miR-206和miR-133b的低表达均分别与结直肠癌远处转移相关，并在远处转移患者中呈低表达。采用Pearson线性相关分析，结果表明，miR-206和miR-133b在结肠癌组织中的表达高度相关。绘制Kaplan-Meier生存曲线，并进行Log-Rank生存分析表明，miR-206和miR-133b表达均与结直肠癌患者总生存期相关，且表达越低，患者预后越差。
　　2、miR-206和miR-133b抑制结直肠癌进展的体外研究
　　细胞分别上调miR-206和miR-133b的表达可以抑制结直肠癌细胞(HCT116和SW480)的增殖、克隆形成、划痕、迁移能力但对细胞周期无影响。
　　3、miR-206和miR-133b通过靶向调控CD47表达抑制结直肠癌进展的作用
　　通过生物信息学预测，筛选出肿瘤相关蛋白CD47，发现CD47是二者共同的预测靶基因。Luciferase双荧光素酶报告基因系统检测表明miR-206和miR-133b可显著抑制野生型CD473'-UTR报告基因活性，但不能抑制突变型CD473，-UTR报告基因活性。qPCR和Western Blot证实过表达miR-206和miR-133b可以在mRNA和蛋白水平均可下调CD47的表达。细胞功能实验表明miR-206和miR-133b通过靶向调控CD47表达，可抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移，及促进结直肠癌细胞的凋亡。
　　4、miR-206和miR-133b通过下调M2型巨噬细胞极化抑制结直肠癌进展的作用
　　建立并验证巨噬细胞M1和M2分化模型。qPCR结果提示M2细胞中miR-206和miR-133b的表达显著低于M1细胞。上调M2亚型巨噬细胞细胞中miR-206和miR-133b的表达，结果表明可以M2亚型巨噬细胞的极化受到抑制并有向M1亚型极化的趋势。分别收集其上清，加入结直肠癌细胞中，结果表明显著抑制结直肠癌细胞(HCT116和SW480)的增殖、克隆形成、划痕、迁移和侵袭能力，也可促进结肠癌细胞凋亡但对细胞周期无影响。
　　5、miR-206和miR-133b抑制结直肠癌进展的体内实验
　　构建并制备miR-206和miR-133b及CD47的mini-circle质粒，用于小鼠AOM/DSS的结肠癌模型实验，每周给药1次，至18周。结果表明miR-206和miR-133b过表达组小鼠结直肠癌的大小、数目、体积均小于对照组，过表达CD47可以部分逆转miR-206和miR-133b对小鼠结直肠癌的抑制作用。Ki-67和Caspase-3的免疫组化结果表明miR-206和miR-133b过表达可以抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡，过表达CD47可以部分逆转这种抗肿瘤作用。另外F4/80的免疫组化结果表明miR-206和miR-133b过表达可以影响肿瘤相关巨噬细胞的水平。
　　6、miR-206和miR-133b抑制结直肠癌进展的机制
　　miR-206和miR-133b在基因组水平受同一启动区调控。生物信息学预测其启动子区有转录因子YY1的结合位点，这提示YY1可能是miR-206和miR-133b的负调控转录因子。上调YY1的表达，miR-206和miR-133b的表达均下调，且能下调miR-206和miR-133b启动子区荧光素酶报告基因的活性。相反，下调YY1的表达，能上调miR-206和miR-133b启动子区荧光素酶报告基因的活性。这表明YY1可以负调控miR-206和miR-133b的表达。因此，YY1介导的miR-206和miR-133b表达下调，可以分别通过调控M2型巨噬细胞途径和CD47表达促进结直肠癌进展的作用。
　　结论:
　　miR-206和miR-133b在结直肠癌组织中均低表达，且与结直肠癌远处转移和预后不良相关;miR-206和miR-133b均可通过调控M2型巨噬细胞极化和CD47表达抑制结直肠癌的进展，而这种作用受上游转录因子YY1的调控。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 miR-206／133b在结直肠癌组织中的表达及与临床特征的关系

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

第二部分 miR-206／133b抑制结直肠癌转移的体外研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

第三部分 miR-206／133b通过调控CD47表达抑制结直肠癌进展的机制

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

第四部分 miR-206／133b通过下调M2型巨噬细胞极化抑制结直肠癌进展的机制

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

第五部分 miR-206／133b抑制结直肠癌进展的体内研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

第六部分 miR-206／133b抑制结直肠癌进展的机制探讨

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

全文小结

参考文献

文献综述 肠道微生态与结直肠癌关系的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢