DDR2参与骨髓间充质干细胞衰老机制及上游转录因子调控的研究

摘要

目的:骨髓间充质干细胞(BMSCs)是残留在成体组织内的一种细胞，具有无限增殖及多方向分化能力、分泌多种细胞因子，由于MSC细胞具有获取便利、免疫原性较低、伦理争议少等特点，而成为再生医学中一种令人关注的干细胞，但是在体外培养中发现复制性衰老现象，同时伴随着增殖及分化能力的下降，成为骨髓间充质干细胞应用的瓶颈之一。本实验通过骨髓间充质干细胞基因芯片表达谱分析找到相关的调控基因，来调控细胞衰老，再通过高通量测序方法检测是否有细菌存在影响骨折愈合，更好的应用在骨不连治疗中。
　　方法:（一）从2014年12月-到2017年1月在手术室收集骨科一病区骨不连患者的软组织及骨组织标本，并与临床患者签署标本采集与研究的知情同意书这部分骨不连患者经历过多次手术仍未骨折愈合，抽血化验炎性指标，放入无菌EP管中立即放入简单5L液氮灌中存放，标本收集完毕后转存到骨科研究所液氮罐中储存，在细菌培养阴性情况下，通过高通量测序方法检测是否有细菌存在影响骨折愈合。（二）2014年12月-到2017年1月在手术室收集骨科四病区关节老年患者（年龄平均75Y）膝关节置换患者的骨髓血，并与临床患者签署标本采集与研究的知情同意书，采用肝素处理注射器无菌条件下抽取骨髓10mL，充分混均后保存于4度冰箱，24小时内分离细胞。选取生长状态良好的第三代BMSCs，加入消化酶开始传代培养，在相差倒置显微镜下观察细胞形态，若发现细胞形态已完全变圆并脱离底部，吹打完毕后，取三个培养瓶（皿）放置到试验台上，每个里边添加5ml细胞悬液，用另一个移液管添加5ml培养基到每个培养瓶（皿），37℃温度下轻轻摇匀培养瓶（皿），放置到5％CO2培养箱中继续培养。取第3、5、6、7代BMSCs，光镜下观察细胞形态，细胞生长曲线直观图，通过EDU增殖实验、β-Gal衰老实验来验证DDR2抑制后的衰老，细胞周期负向调控因子检测各代BMSCs基因差异表达、组蛋白H2A.X Ser139磷酸化水平与DNA损伤的关连，通过qPCR来检测晚代BMSCs衰老marker基因。染色体免疫共沉淀实验(ChIP)来验证DDR2启动子区组蛋白H3R17的甲基化CARM1参与进来情况，通过表观遗传学修饰甲基化与否影响基因表达。
　　结果:利用半定量PCR技术在体外长期培养自然衰老BMSCs中检测，结合GEO数据库中BMSCs基因表达谱数据分析认为DDR2表达被抑制后细胞增殖能力减弱，细胞结构功能相应的改变、DNA损伤、衰老阳性细胞增多，CARM1表达被抑制后，与DDR2被抑制后情况相符合即DNA损伤、P16水平下调。CARM1、DDR2的水平过表达与补救实验也验证了此通路过程。CARM1通过甲基化表观调控方式来修饰DDR2区域H3R17水平来调控DDR2表达水平。
　　结论:（一）通过高通量测序方法检测到细菌的存在，细菌微环境的改变可能会影响到骨折的愈合能力及时间（二）BMSCs晚代细胞增殖能力的下降是细胞衰老的一种表现，半定量PCR技术发现DDR2调控BMSCs水平，CARM1通过甲基化来影响DDR2调控BMSCs衰老。

目录

声明

摘要

缩略词汇总表

第一部分：骨不连临床特征分析及低毒感染样本高通量测序分析

前言

材料与方法

结果

第二部分：骨髓间充质干细胞衰老机制分析及调控基因筛选

前言

方法与材料

结果

第三部分：骨髓间充质干细胞衰老细胞的建立及观察

材料与方法

结果

第四部分 骨髓间充质干细胞衰老机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述 骨不连治疗方法的研究进展

致谢

附录