CaMPARI在三叉神经血管源性偏头痛大鼠模型中的应用研究

摘要

偏头痛的发病机制尚未完全清楚，三叉神经血管痛觉通路激活被认为是最能全面揭示偏头痛发病进展机制的学说，这种学说认为在偏头痛大鼠模型中，三叉神经节作为经典上行疼痛传导通路的起始部位，它的激活在偏头痛的产生和维持过程中起关键作用。然而目前关于三叉神经节细胞的激活研究尚不清楚。传统的方法证实三叉神经节细胞的激活可引起细胞内钙离子一次爆炸性的升高，且有高度的细胞特异性，但在偏头痛发病进展过程中，具体如何激活，激活顺序等尚不清楚。CaMPARI荧光蛋白因为其对胞内钙离子高度敏感，且具有不可逆转变为紫红色荧光的特性，故可用来给激活的三叉神经元作标记，即可实现将瞬间的神经元激活转变为永久的荧光蛋白的表达。然而目前，CaMPARI是2015年新合成的一段基因序列，仅被证实可在斑马鱼、果蝇、小鼠模式生物组织中表达，它是否可用通过腺相关病毒转导至大鼠三叉神经节细胞，从而为我们研究三叉神经节细胞激活在偏头痛大鼠模型发病进展中的作用提供一个新的思路呢？这是本研究想要解决的问题。
　　目的：
　　CaMPARI是否可通过腺相关病毒转导办法表达在大鼠三叉神经节细胞。
　　方法：
　　1.验证空载AAV-9-hSyn-GFP可成功转染至大鼠三叉神经节细胞
　　首先使用亚甲蓝确定200-250gSD雄性大鼠三叉神经节的立体定位注射坐标，将空载AAV-hSyn-2-GFP、AAV-hSyn-8-GFP、AAV-hSyn-9-GFP三个血清型分别以不同剂量2uL，5ul，8uL直接注射至大鼠三叉神经节细胞。对照组大鼠给予等量生理盐水注射。2-3周后，取材冰冻切片于荧光显微镜下观察GFP绿色荧光蛋白表达情况，从而确定后续实验选用的血清型和病毒剂量。
　　2.AAV-hSyn-9-CaMPARI腺相关病毒的制备
　　首先Addgene官网上订购pcDNA3-CaMPARI(Plasmid＃60421)，挑穿刺菌，单克隆培养，质粒提取，测质粒浓度，测序鉴定比对，病毒包装。
　　3.验证CaMPARI荧光蛋白在大鼠三叉神经节细胞表达
　　健康雄性SD大鼠，将8uL AAV-hSyn-9-CaMPARI立体定位注射入大鼠三叉神经节，2-6周后取材荧光显微镜下成像。生理盐水作空白对照。过程中避光，保证三叉神经节置于不合钙的kerb氏溶液中。
　　结果：
　　AAV-hSyn-9-CaMPARI在注射后2-3周可高效率表达在大鼠三叉神经节细胞中，至少持续28天。
　　结论：
　　CaMPARI可通过腺相关病毒转导表达在大鼠三叉神经节细胞，这为以后进一步研究三叉神经节细胞在偏头痛大鼠模型的激活奠定了基础。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

第一节、空载AAV-9-hSyn-GFP转导至大鼠三又神经节细胞

一、材料

二、实验方法及步骤

三、结果

第二节、AAV-hsyn-9-CaMPARI制备、注射与表达

一、材料

二 主要试剂的配制

三 实验方法及步骤

四 结果

五 讨论

六 结论

七 展望

参考文献

文献综述 瞬时受体电位A1通道在神经病理性疼痛中的研究进展

附录

攻读学位论文期间发表文章情况

致谢