中药抗肺癌反应性基因研究及中医综合治疗临床研究方法探讨

摘要

肺癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，2002年世界卫生组织统计，估计有1352132新发病例和1178918人死亡(WHO2002)。发病率发达国家多于发展中国家，在肿瘤患者中，男性肺癌占30.9％，女性占12.6％。近年来，肺癌发病率在我国增长很快，2002年我国肺癌发病在男性为269650人，女性为126718人(WHO2002)。Meta分析显示化疗对非小细胞肺癌治疗不敏感。没有足够的证据表明，任何放疗方案对非小细胞肺癌有较大的缓解，大剂量带来更多的毒性作用，体能状况较好的病人给予大剂量可适当增加生存期(1年6％，2年3％)。术后放疗对早期完全切除的非小细胞肺癌是有害的，不能做为此类患者的常规治疗，对N2肿瘤的治疗作用还不清楚。提高肺癌疗效的措施是多学科综合治疗，其中中医药治疗占有重要地位。　　中药抗肿瘤反应性基因研究部分选择基础研究比较充分，临床应用多年的中药康莱特注射液(薏苡仁脂的静脉油乳剂)，进行其抗LA795肺腺癌小鼠肺转移的中药反应性基因研究。本研究是国家自然科学基金项目(30070957)：薏苡仁脂抗肿瘤转移反应性基因研究的第二部分，并根据前期中药抗癌症恶病质基因芯片研究(国家中医药管理局课题)实验结果，筛选出三张芯片差异表达基因27条，表达增高基因25条，表达降低的基因2条。两张芯片的差异表达基因52条。接种部位瘤组织差异表达基因14条，共93条差异表达基因。文献检索发现约21条差异表达基因与肿瘤相关，其中多与肿瘤免疫相关，进一步检索肿瘤免疫相关基因37条，加入看家基因20条，定制含150条50-mer基因的康莱特中药反应性相关基因寡核苷酸围栏芯片，评价康莱特注射液对LA795肺腺癌小鼠基因表达的影响，通过实验来研究康莱特抑制肿瘤的分子机制及寻找潜在的新的一些治疗靶点。　　首先进行康莱特的抑瘤实验，观察康莱特组体重增加最多，环磷酰胺组体重增加较少，有比较显著统计学意义(P＜0.05)。康莱特组和荷瘤对照组体重增加差异不显著，但由于荷瘤对照组小鼠瘤体较大，小鼠净重康莱特组最大，环磷酰胺组其次，荷瘤对照组最小。实验首先重复LA795肺腺癌转移模型，康莱特抑瘤率为66.92％，与荷瘤对照组比较，具有非常显著性差异(P＜0.01)，与环磷酰胺比较无明显差异，绘制肿瘤生长曲线。康莱特组肺转移率为93.3％，但转移灶以Ⅱ组居多；与对照组比较差异非常显著(P＜0.01)。康莱特组与环磷酰胺组比较，无明显差异(P＞0.05)。　　选择北京博奥生物芯片有限责任公司的寡核苷酸(Oligo)芯片技术，点制成每基因50个核苷的围栏芯片，即挑选的150个基因在每张玻片上共点制成4个亚阵，每个亚阵包括450个基因(即150个基因重复点三次)，每个亚阵可以独立为一对样本(对照样本和实验样本)进行杂交反应。正常对照组、荷瘤对照组肺组织分别混合，康莱特随机取三只小鼠肺组织，分别提取mRNA。以定制的Oligo芯片进行杂交反应、荧光标记，并进行荧光交换，即在芯片上每个基因重复3次，荧光交换处理以后每个基因会有6次重复结果，用t-检验的方法挑选差异基因。　　在95％显著性水准上为显著差异，整理出康莱特三张芯片相同差异表达基因，差异大于1.5倍以上，且趋势一致基因10条，其中表达上调8条，分别是AA051577、AW549803、M63244、M75721、NM007606、NM008302、NM_025567、X66032；下调2条，分别是AF184981、U13921。与正常对照组比较，趋势一致的基因有5条，分别是AF184981、AW549803、NM007606、NM008302、NM025567。其中：肿瘤抑制基因cyclinB2在康莱特用药后三组实验中均表达上调，考虑cyclinB2在G2/M期大量表达，阻滞细胞周期中G2/M时相细胞，减少有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞增殖。鼠的CyclinB2促进剂受细胞周期依赖素(CDC)的调节，cdc2促进细胞转移明确地与cyclinB2相关。康莱特促进cyclinB2表达，有可能抑制cdc2表达，进而抑制肿瘤细胞的转移。与荷瘤对照组相比，肿瘤转移受到抑制的康莱特治疗组KLT1、KLT2、KLT3的alpha-1PI-1分别上调为1.7786，2.1292和1.1629，而在正常对照组没有差异表达，并经实时定量RT-PCR证实。说明康莱特具有促进alpha-1蛋白抑酶基因表达的作用，可能进而抑制肿瘤生长。IL-1在三组样品中均表达下调为0.7314，0.7509，0.7179，而正常对照组表达下调为0.4451，说明康莱特具有一定的恢复肿瘤恶病质升高的IL-1水平的作用，但未能恢复至正常水平。同时，康莱特抑制肿瘤细胞转移可能是通过上调alpha-1水平，作为体液抑制剂来抵抗IL-1的产生。康莱特具有恢复细胞色素C、等至正常水平的作用，可能通过诱导细胞色素C的释放来抑制T细胞调亡，进而提高抗肿瘤免疫、。康莱特具有恢复碳酸脱水酶3至正常水平，下调FMO2的表达，可能通过这一机制改善机体的新陈代谢，抑制肿瘤，缓解肿瘤恶病质状态。　　临床部分考虑到辨证施治是中医的特色，即需要根据患者的具体证候，而不是根据肿瘤的病理类型决定采用何种治疗方案。在确定了治疗方案后，中医还要对方剂进行加减，不同患者的治疗差异很大。因此研究过程中处理因素难以统一，从而造成试验可重复性差，随机对照实验(RCT)难以进行。医生需根据患者的不同证候开具不同配伍中药，研究中也很难遵循盲法的试验设计原则。　　根据中医药治疗肿瘤的特点，特别是导师提出的中医综合治疗肿瘤的理论，针对晚期非小细胞肺癌，利用计算机SQLsever数据库技术，设计晚期非小细胞肺癌临床病例分析数据库系统，从实在病例中抽取实际治疗的东西，反应临床实际治疗的情况，总结中医综合治疗肿瘤的特点，特别是中医辨证论证的特色。避免一方一药人为地设计实验方案进行临床实验存在的种种弊端，希望借此研究，抛砖引玉，探索一条新的临床研究方法。　　其中辨证论证有效方药部分，为了体现不同医师经验的程度不同，采用加权的方法，主任医师×3，副主任医师×2，主治医师及医师×1。随访102例患者中，存活8例，中位生存期11月(6月-38月)，1年生存率为35.3％。其中研究生期间临床系统观察的32例患者中位生存期为11.5月(6.2月-24.5月)，1年生存率为37.5％。中医综合治疗后卡氏评分较前增加，体重稳定，可有效改善患者神疲乏力、少气懒言、气短、咳嗽、痰多、疼痛、纳谷少馨、痰中带血、大便干结、口干咽燥、便溏、腹胀、腰膝酸软等症候。其中神疲乏力、少气懒言、咳嗽、痰多、疼痛、纳谷少馨、痰中带血、大便干结、便溏等症候的改善与治疗前比较，具有非常显著的意义(P＜0.01)；气短、口干咽燥、腹胀、腰膝酸软等症候的改善与治疗前比较，具有显著的差异(P＜0.05)。可以有效改善食欲、精神、疲乏、疼痛、自身对癌症的认识、对治疗的态度等。精神、疲乏、疼痛具有非常显著性差异(P＜0.01)。食欲、自身对癌症的认识、对治疗的态度具有显著性差异(P＜0.05)。提高CD4、CD4/CD8、NK细胞活性。CD4与治疗前相比，具有显著性差异(P＜0.05)，CD4/CD8、NK细胞活性与治疗前相比，具有非常显著性差异(P＜0.01)。　　从计算机分析结果可以看出，辨证分型中肺气虚约占32.4％；脾气虚约占31.4％；肺阴虚约占28.2％；肾阴虚14.7％；痰湿40.2％；瘀血约占20.6％。以方测证进行辨证治则统计，扶正为主约占60.8％，祛邪为主约占39.2％，补气约占34.3％，润肺约占33.3％，健脾约占37.3％，滋肾约占14.7％，祛痰约占34.3％，化瘀约占17.6％，止咳约占17.6％，清热约占29.4％。分析晚期非小细胞肺癌正虚邪实是其基本病机，且以正虚为主，正虚之中又多表现为肺气虚、肺阴虚、脾气虚及肾阴虚。邪实则为痰湿、瘀血，为本虚标实之证，辨证分型又以肺脾肾的气阴两虚、痰瘀内阻为主。与前面综述结论基本吻合。　　采用加权的方法计算出现的20次以上的高频药对为：沙参、麦冬；南沙参、北沙参；麦冬、天冬；半夏、黄芩；鬼箭羽、石见穿；天南星、半夏；鸡内金、谷麦芽；半夏、竹茹；女贞子、山茱萸。以数据库方法总结名老中医临床经验有一定的实际意义。

目录

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摘要

第一部分：康莱特抗LA795肺腺癌转移中药反应性基因研究

前言

1.康莱特抗肿瘤转移反应性基因芯片的设计

1.前期研究基础

2.康莱特抗肿瘤转移相关基因芯片的设计

2.康莱特对LA795肺腺癌小鼠的抑瘤作用

1.材料与方法

2.实验结果

3.康莱特抗LA795小鼠肺腺癌中药反应性相关基因芯片研究

1.材料与方法

2.基因表达谱差异结果

4.实时定量RT-PCR验证

1.实验原理

2.实验步骤

5.康莱特中药反应性相关基因芯片结果分析

1.实验结果分析

2.存在的问题及设想

参考文献

第二部分：

综述：中医药治疗非小细胞肺癌研究进展

中医综合治疗晚期非小细胞肺癌临床研究方法探讨

前言

1.研究对象

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

个人简历

致谢