从益髓生血颗粒调控β-珠蛋白及相关基因表达探讨肾生髓理论的分子机制

摘要

本研究是在导师吴志奎研究员肾生髓理论现代研究与临床实践的学术思想指导下，以国家自然基金资助课题为依托，把中医的理论思维和前沿技术有机结合，对益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血的整体效应和疗效的分子机制进行研究。在该药取得显著临床疗效的基础上，采用ELISA、RT-PCR、激光共聚焦显微镜扫描技术、凝胶滞后试验、real-timePCR、DDRT-PCR等实验技术，从造血刺激因子的表达，β-珠蛋白基因簇LCRHS2序列DNA与蛋白质相互作用，珠蛋白基因表达调控发挥重要作用的红系特异的反式作用因子基因的表达，以及与红细胞溶血相关的铁蛋白基因表达等方面，多层次研究了益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血调控珠蛋白基因表达的分子机制，取得了有学术价值的研究结果。　　本文从肾生髓与藏精的内在关系、肾生髓与髓养骨、肾生髓通于脑以及肾生髓生血四个方面，对历代有关肾生髓理论的文献论述进行分析归纳，以期加深对经典肾生髓理论的认识。通过对近年来有关肾生髓理论现代研究的相关文献分析归纳，从肾生髓与神经系统功能的相关性、肾生髓和髓养骨物质基础的现代研究、肾生髓与髓生血的客观性研究和肾生髓理论分子机制的研究等方面，总结肾生髓理论的现代研究成果，为中医经典理论的现代研究探索新的思路和方法。　　本文通过对珠蛋白基因簇的组织及表达的时空顺序性、珠蛋白基因的结构与表达、珠蛋白基因表达与红系分化起重要作用的转录因子、珠蛋白基因的顺式作用元件以及β-珠蛋白基因簇位点调控区的功能等方面分析归纳，了解珠蛋白基因表达调控的作用机制，更深入的认识珠蛋白生成障碍性贫血的发病机制，为临床研究提供理论依据；总结导师多年来的运用补肾生血中药治疗β-地中海贫血的研究成果，深入学习导师的学术思想和科研思路。　　本文从两个方面对益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血的整体效应进行了研究，研究结果表明，采用随机单盲安慰剂平行对照进行临床观察，研究结果显示：治疗组血液学参数Hb、RBC、Ret、HbF自给药第1个月至治疗结束均明显提高，安慰剂对照组无明显变化；治疗组患者肝脾肿大明显缓解，B超显示患者脾脏横径治疗后明显小于治疗前；治疗后患者临床中医证候明显改善，临床证候的明显改善与血液学参数的升高有很好的一致性；激光共聚焦显微镜扫描技术显示：患者经益髓生血颗粒治疗后，骨髓幼稚红细胞内DNA和RNA的荧光强度明显提高，表明益髓生血颗粒对维持骨髓早期造血细胞的正常结构和生理形态有促进作用。　　本文通过ELISA、real-timePCR技术，检测患者外周血和骨髓造血刺激因子的表达，研究显示：益髓生血颗粒可以明显提高患者骨髓中GM-CSF的表达，干预由GM-CSF介导的造血祖细胞的分化过程，促进有效红细胞生成，缓解贫血症状；益髓生血颗粒通过增加患者外周血中c-kit基因的表达量，调节SCF/c-kit信号传导途径，恢复患者在红系祖细胞和多种造血细胞分化成熟过程中出现的异常病理改变，达到治疗目的。益髓生血颗粒对造血祖细胞的分化和成熟的调节，还体现在改变患者体内EPO和EPOR基因的表达量方面。通过降低造血刺激因子EPO的表达，促进有效红细胞生成，HbF合成增加，降低游离α-珠蛋白链的毒害作用；降低EPOR基因的表达量，减少无效红细胞的生成，使正常造血功能得到恢复。通过上述实验研究结果，我们认为益髓生血颗粒可以调节造血刺激因子基因表达，干预SCF-GM-CSF-EPO轴的生理功能，证明SCF-GM-CSF-EPO轴促进红系祖细胞分化成熟的生理功能是肾生髓生血理论的物质基础之一。　　3、凝胶滞后实验结果显示，患者经益髓生血颗粒治疗后，骨髓有核细胞β-珠蛋白基因簇LCRHS2位点DNA与核蛋白相互作用发生改变，出现结合作用改变的序列中包含了两个GATA结合膜体；通过珠蛋白基因表达调控特异调节因子与结合膜体相互作用的改变，HbF合成增加，降低游离α-珠蛋白链对有活性细胞的毒害作用，调节红系祖细胞分化和成熟，促进有效红细胞生成。　　4、real-timePCR检测益髓生血颗粒调节珠蛋白基因表达调控的反式作用因子基因表达的研究显示：①益髓生血颗粒可以显著提高骨髓有核细胞GATA-1、GATA-2基因的表达量；GATA-1可以促进γ-珠蛋白基因的表达，增加HbF的生成；刺激α-珠蛋白链稳定蛋白(AHSP)生成，可使游离的α-珠蛋白链生成稳定的无β-珠蛋白链的纯α-血红蛋白，缓解其在血液和肝有活性细胞中沉积所致的毒害作用。GATA-2可以协同GATA-1作用，促进红系组细胞正常分化，增加有效红细胞生成；②益髓生血颗粒可以明显增加骨髓有核细胞NF-E2基因的表达量，促进珠蛋白基因转录和有效红细胞生成；调节体内铁的吸收和代谢，有效的缓解体内铁沉积，降低铁负荷；③益髓生血颗粒对EKLE、FKLF基因的表达未发现明显的调节作用。　　5、DDRT-PCR实验显示，患者经益髓生血颗粒治疗3个月后，骨髓有核　　细胞中铁蛋白基因的表达量显著降低；该药还可以调节与铁蛋白代谢相关的　　NF-E2基因的表达。研究提示，益髓生血颗粒通过干预铁蛋白的代谢途径，促　　进体内铁的吸收和代谢，有效的降低体内铁负荷，对体内的铁蓄积进行有效　　的控制，使红细胞的破坏得到恢复。通过实验研究验证了中药治疗可以改变　　与本病相关功能基因表达假说的科学性。　　三、本研究的创新之处　　1、首次从珠蛋白基因表达调控及红系特异反式作用因子基因的表达及β　　-珠蛋白基因簇LCR区HS2位点DNA与蛋白质相互作用的改变，探讨中药治　　疗β-地中海贫血患者调控珠蛋白基因mRNA表达的分子机制，在地中海贫血　　疗效机理的研究方面，国内外未见类似研究报道。　　2、从益髓生血颗粒调节造血刺激因子基因表达，干预SCF-GM-CSF-　　EPO轴的生理功能，促进红系祖细胞正常分化和成熟，增加有效红细胞生成，　　验证了SCF-GM-CSF-EPO轴促进红系祖细胞分化成熟的生理功能是肾生　　髓生血理论物质基础的客观性。　　3、研究发现中药治疗可以降低患者骨髓有核细胞铁蛋白基因的表达，缓　　解因红细胞破坏所致的体内铁沉积，这一改变可能是疗后患者血液学参数明　　显提高的分子机制之一；提出了中药治疗β-地中海贫血可改变功能基因表达　　的假说，并验证了它的客观性。　　4、中医理论思维与前沿技术有机结合，从深层次验证了中医肾生髓理论分子基础的科学内涵，使该经典理论的现代研究从理论到实践达到新的水平。

目录

原创性声明和关于学位论文使用授权的声明

英文缩略语

前言

上篇理论研究

第一章肾生髓理论的形成与发展

一、肾生髓与藏精的内在关系

二、肾生髓与髓养骨

三、肾生髓通于脑

四、肾生髓与髓生血

参考文献

第二章肾生髓理论的现代研究进展

一、肾生髓与神经系统功能的相关性

二、肾生髓与髓养骨物质基础的现代研究

三、肾生髓与髓生血的客观性研究

四、肾生髓理论的分子机制研究

五、问题和展望

参考文献

第三章珠蛋白基因的表达调控及开关机制

一、珠蛋白基因簇的组织及表达的时空顺序性

二、珠蛋白基因的结构与表达

三、珠蛋白基因表达与红系分化起重要作用的转录因子

四、珠蛋白基因的顺式作用元件

五、β-珠蛋白基因簇位点调控区

参考文献

第四章中药治疗地中海贫血的分子基础与临床研究

第五章地中海贫血的药物治疗进展

一、输血配合铁螯合剂治疗

二、γ-珠蛋白基因激活剂

三、珠蛋白合成调节剂

四、α-肽链合成抑制剂

五、中医药治疗

六、展望

参考文献

理论研究总结

下篇益髓生血颗粒调控珠蛋白及相关基因表达的研究

第一章益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血整体效应的研究

第一节益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者血液学参数及相关症候的影响

第二节益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者骨髓幼稚红细胞DNA和RNA荧光强度的影响

小结

第二章益髓生血颗粒对造血刺激因子表达的影响

1 ELISA检测治疗前后患者外周血EPO含量的改变

2 real-time PCR检测患者治疗前后外周血中EPO R、c-kit及骨髓血中SCF基因表达的改变

3讨论

小结

参考文献

第三章益髓生血颗粒对β-珠蛋白LCR HS2位点DNA与核蛋白结合作用的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第四章益髓生血颗粒对珠蛋白表达调控反式作用因子基因表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第五章：益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者铁蛋白基因表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

实验研究总结

结语

致谢

研究生个人简介

攻读博士期间发表论文、参加课题及参加学术会议

附件 β-地中海贫血诊断标准和疗效评定标准