高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的蛋白质组学研究

摘要

高脂血症及动脉粥样硬化属于中医“痰浊”、“血瘀”范畴，痰浊血瘀是高脂血症及动脉粥样硬化的重要病机早已成为共识，高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候可能是机体在血浆蛋白质水平发生了某些改变产生的后果，这些发生改变的蛋白质与动脉粥样硬化、高脂血症等疾病密切相关。寻找发生改变的蛋白质与高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的关系，将有利于深刻揭示痰瘀证候的生化基础和病因病机。 本研究以国家自然基金资助的“有关中医药几个关键问题”之一的“高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的蛋白质组学”课题为依托，把中医的基础理论与前沿的现代科学技术相结合，对证候在蛋白质表达水平上的变化及可能的差异蛋白质与证候各种影响因素的相关性进行了深入的探讨。 方法 1.采集符合条件的146例高脂血症及动脉粥样硬化痰证、瘀证、痰瘀互阻证和非痰非瘀类证候(其他证型)患者及37例健康对照的血浆样品，采用GE公司的IPGphor等电聚焦仪、DALTSIX垂直电泳仪等仪器进行双向电泳。 2.利用GE公司的图像分析软件ImagmAster2-DEplatinum6.0对血浆样品的凝胶图谱进行分析。 3.利用Fisher判别法筛选差异蛋白质的典型成分及图模型分析方法对差异蛋白质进行相关性分析。 结果 1.双向电泳实验获得的电泳图谱经软件分析，对变异度在70﹪以上的差异蛋白质进行分析，得到以下几方面的结果： (1)有31种差异表达的蛋白质可能是高脂血症及动脉粥样硬化的标志蛋白质群，其中有18种蛋白表达量较正常人呈现上调趋势，13种蛋白表达量呈现下调趋势。 (2)上述31种高脂血症及动脉粥样硬化的标志蛋白在痰瘀类证候中有16种蛋白表达量较非痰非瘀类证候呈现升高趋势，15种蛋白表达量呈降低趋势。 (3)31个差异蛋白质中，表达量最低的蛋白质分布，非痰非瘀类证候5个，痰证3个，瘀证8个；痰瘀互阻证8个，其中包含2个瘀证特有的标志蛋白，仅包含1个痰证的标志性蛋白。表达量最高的蛋白质分布，非痰非瘀类证候9个，痰证7个，瘀证6个；痰瘀互阻证5个，其中包含2个瘀证特有的蛋白质和1个痰证特有的蛋白质。 (4)可能标志高脂血症及动脉粥样硬化证候相互关系及演变规律的蛋白质(如下表，括号内数字为凝胶上蛋白质的ID) 2.对上述差异蛋白质进一步筛选，对变异度在100﹪以上的11个蛋白质进行Fisher判别和相关性分析。筛选能够区分两组间具有显著性差异的典型成分，选择对该典型成分贡献大的蛋白质作为可能区分两组的标志蛋白。发现： (1)区分正常和高脂血症及动脉粥样硬化病人的标志蛋白质为：1481、1521； (2)区分非痰非瘀类证候与痰瘀类证候可能的标志蛋白质为：1383、1635； (3)区分痰证和瘀证可能的标志蛋白质为：1521、1563、1688、1666； (4)区分痰证和痰瘀互阻证可能的标志蛋白质为：1481、1539、1635； (5)区分瘀证和痰瘀互阻证可能的标志蛋白质为：1456、1563。 3.标志蛋白与脏腑功能及其他因素的关系 (1)分析高脂血症及动脉粥样硬化病人可能的两个标志性蛋白质1521、1481群的相关性，发现两者与脏腑功能均不相关，1521与TG、HDL、内膜厚度、既往高血压，动脉粥样硬化之间存在相关性，与其余因素均无关；1481与LDL、C反应蛋白、动脉粥样硬化病史相关，与其余因素均无关。 (2)分析痰瘀类证候的两个标志蛋白质1383、1635群的相关性，发现1383与肾气虚、TC、HDL、LDL、AI、内膜厚度及斑块面积、既往动脉粥样硬化、家族史及用药情况、运动情况存在相关性；1635与肾气虚及心气虚、C反应蛋白、既往动脉粥样硬化存在相关性。 (3)分析区分痰证和瘀证的主要标志蛋白质1521、1563、1666、1688，发现1521与肾气虚、TC、TG、AI、切变率为30的血液黏度、用药情况、吸烟及饮酒情况；1563与心气虚、肾气虚、管腔内径，内膜厚度，斑块面积、切变率为30的血液黏度、既往高血压及动脉粥样硬化、用药情况、吸烟及饮酒情况存在相关性；1666与心气虚、肾气虚、内膜厚度、用药情况、吸烟及饮酒情况存在相关性，与其余指标均无关。1688与与脏腑功能关系不大，与既往高血压及动脉粥样硬化、用药情况、吸烟及饮酒情况存在相关性。 (4)分析区分痰证、痰瘀互阻证的主要标志蛋白质1481、1539、1635，发现1481与心气虚、肾气虚及脾气虚、AI、C反应蛋白、切变率为5时的血液黏度、PLT、家族史、吸烟及饮酒情况之间存在着直接的相互关系；1539与心气虚、肾气虚及脾气虚、TC、C反应蛋白、管腔内径、纤维蛋白原、切变率为1、5、200时的血液黏度、体重指数、既往高血压及动脉粥样硬化、家族史、用药情况、吸烟及饮酒情况等方面存在相关性。1635与心气虚、肾气虚及脾气虚、切变率为1、200时的血液黏度、PLT、家族史等方面存在相关性。 (5)分析区分瘀证、痰瘀互阻证的两个标志蛋白质1456，1563与各因素的相关性，发现1456与心气虚、肾气虚及脾气虚、内膜厚度、切变率为1时的血液黏度、纤维蛋白原及红细胞压积、家族史、运动情况、吸烟及饮酒情况之间存在相关性；1563与脾气虚、切变率为5和30时的血液黏度、HGB及HCT、既往动脉粥样硬化病史、用药情况、吸烟及饮酒情况之间存在相关性。 结论 1.首次将血浆蛋白质组学技术用于高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候研究。 2.首次将Fisher判别分析筛选典型成分方法和图模型的分析方法应用于判别痰瘀证候的典型成分，分析其与不同影响因素的相关性。 3.疾病和正常之间及不同痰瘀证候之间在蛋白质组水平上存在蛋白表达差异，并且差异表达的蛋白质在痰瘀证候之间存在一定的变化规律。 4.痰证、瘀证和痰瘀互阻证三种不同证候分别有其可能标志蛋白群。其中痰瘀互阻证的标志蛋白群中包含部分痰证和血瘀证的标志蛋白，且血瘀证占的比例高于痰证，表明本项研究中的痰瘀互阻证是以瘀证为主兼夹痰证。 5.对痰瘀证候间的相互关系及变化规律分析，发现绝大部分差异表达蛋白质都随着由非痰非瘀证—痰证—瘀证—痰瘀互阻证或由痰证—瘀证—痰瘀互阻，以及由非痰非瘀证—痰证—瘀证的传变过程，呈现有规律性表达量升高或降低趋势，这种变化规律揭示了临床上的痰瘀变化规律主要是由痰致瘀这一事实。 对2-DE凝胶通过分析软件获得的高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候差异蛋白质表达谱应用Fisher典型分析方法和图模型等方法分析取得如下几方面重要发现： 1.高脂血症及动脉粥样硬化病人血浆中标志蛋白群为：1521、1481。 2.高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀类证候血浆中标志蛋白群为：1383、1635。 3.痰证血浆中标志蛋白群为：1481、1539、1635。 4.瘀证血浆中标志蛋白群为：1521、1563、1666、1688。 5.痰瘀互阻证血浆中标志蛋白群为：1456、1563。 6.区分不同证候间的可能标志蛋白与脏腑功能间存在不同的相关性，其中与痰瘀类(包括痰证、瘀证及痰瘀互阻证)相关的标志蛋白质主要与心气虚及肾气虚有关；与痰证相关的标志蛋白质主要与心气虚、肾气虚及脾气虚有关；与瘀证相关的标志蛋白主要与心气虚及肾气虚有关；与痰瘀互阻证相关的标志蛋白质主要与肾气虚及心气虚有关，脾气虚次之。 7.不同脏腑功能相关的标志蛋白与血脂及脂蛋白代谢、CRP、血液流变学参数、血管壁受损程度、用药及疾病史、烟酒嗜好、运动等因素作进一步分析，发现： 7.1痰瘀类证候的标志蛋白群中 与肾气虚相关的标志蛋白1383表达量的升高与TC、HDL、LDL、AI、内膜厚度及斑块面积、既往动脉粥样硬化、家族史及用药、运动情况存在相关性；与肾气虚及心气虚相关的标志蛋白1635表达量的降低与C反应蛋白、既往动脉粥样硬化存在相关性； 7.2痰证的标志蛋白群中 与心气虚、肾气虚及脾气虚相关的标志蛋白1481表达量的升高与AI、C反应蛋白、切变率为5时的血液黏度、PLT、家族史、吸烟及饮酒情况之间存在相关性。 与心气虚、肾气虚及脾气虚相关的标志蛋白1539表达量的降低与TC、C反应蛋白、管腔内径、纤维蛋白原、切变率为1、5、200时的血液黏度、体重指数、既往高血压及动脉粥样硬化、家族史、用药情况、吸烟及饮酒情况等方面存在相关性。 与心气虚、肾气虚及脾气虚相关的标志蛋白1635表达量的降低与切变率为1及200时的血液黏度、PLT、家族史等方面存在相关性。 7.3瘀证的标志蛋白群中 与肾气虚相关的标志蛋白1521表达量的降低与TC、TG、AI、切变率为30的血液黏度、用药情况、吸烟及饮酒情况存在相关性。 与心气虚、肾气虚相关的标志蛋白1563表达量的降低与管腔内径，内膜厚度，斑块面积、切变率为30的血液黏度、既往高血压及动脉粥样硬化、用药情况、吸烟及饮酒情况存在相关性。 与心气虚、肾气虚相关的标志蛋白1666表达量的降低与内膜厚度、用药情况、吸烟及饮酒情况存在相关性。 与脏腑功能关系不大的标志蛋白1688表达量的升高与既往病史高血压及动脉粥样硬化、用药情况、吸烟及饮酒情况存在相关性。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

英文缩略词中英文对照

文献综述1高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀同病的研究现况

文献综述2蛋白质组学相关技术研究进展

前言

材料与方法

结果

第一部分血浆蛋白质差异表达谱

第二部分Fisher判别法分析各组间的典型成分

第三部分相关性分析

本章小结

讨论

参考文献

所使用试剂配方

致谢