脉络宁复合液治疗大鼠激素性股骨头坏死机理的实验研究

摘要

1研究背景:
　　 股骨头缺血性坏死(Avascular Necrosis of the Femoral Head简 ANFH)是因创伤或非创伤等诸多因为导致股骨头的骨细胞、骨髓、造血细胞及脂肪细胞因缺血坏死,骨组织营养中断,最终造成股骨头密度增高或减低,骨囊性改变,骨小梁断裂,股骨头塌陷畸形等一系列病变,称为股骨头缺血性坏死。
　　 目前国内外对于股骨头坏死的治疗临床多以手术疗法为主,其近期效果明显,但远期效果不理想。中医药综合疗法以保留骨结构及其功能为目的,从整体观念出发,内外并治,筋骨并重,以动静结合为原则而进行辨证论治,弥补了手术疗法之不足。我导师根据传统中医药理论,并结合临床实践创建了脉络宁复合液神经阻滞疗法治疗股骨头缺血性坏死,取得了满意的疗效。脉络宁复合液由脉络宁、2％利多卡因、5％碳酸氢钠按一定比例配伍而成。脉络宁为纯中药制剂,由牛膝、玄参、金银花、石斛组成,具有活血化瘀、滋阴养血、清热解毒的功效。主要用于治疗血栓闭塞性脉管炎、脑血栓形成及后遗症等病。脉络宁注射液组方中虽然未见活血化瘀中药,但其化学有效成分为绿原酸、阿牙品、滨蒿内脂和香豆素类化合物,能扩张血管,改善微循环,提高纤溶活性,降低纤维蛋白原含量,降低血液粘稠度,增加血流量,具有抗凝血、溶血栓作用,说明其确实有活血化瘀的功效。利多卡因局部神经阻滞可以切断疼痛的恶性循环,解除肌肉的痉挛,降低了髋关节内部的压力；
　　 2研究目的
　　 通过小剂量激素长期应用制备股骨头坏死模型,应用脉络宁复合液疗法进行干预,观察治疗前后的变化。应用HE染色的方法,从组织形态学方面观察股骨头坏死的病理变化；应用免疫组织化学的方法,观察各组大鼠股骨头组织中影响骨生长和修复的多种生长因子的变化情况。检验脉络宁复合液治疗大鼠激素性股骨头坏死的疗效,从组织形态学和分子生物学进一步认识脉络宁复合液治疗该病的机理,为临床治疗提供理论基础。
　　 3研究方法
　　 3.1材料及方法
　　 选用26只wistar雄性成年大白鼠(贰级,由中国中医研究院实验动物中心提供,动物合格证号为SCXK(军)2002-001),体重290±20g。随机分为激素模型组(以下称模型组)10只,脉络宁复合液治疗组(以下称治疗组)10只,空白对照组(以下称空白组)6只。其中模型组和治疗组,腹腔注射醋酸强的松龙6.7mg/kg,3次/周,连续三周。造模成功后,治疗组从第4周开始在闭孔神经注射脉络宁复合液2ml/kg,3次/周,共8周；定位选用贝朗神经定位仪进行定位,定位前于大鼠右侧腹股沟处局部备皮,利多卡因凝胶局部均匀涂抹,以利于定位笔更好的与局部接触,定位笔发出电刺激后,发现股内侧肌群有节律跳动,调节刺激电量,当电量达到50mA时,股内收肌群仍然继续跳动,即为闭孔神经在体表的准确位置。治疗组、模型组和空白组大鼠一起于治疗给药后第9周的第一天取材,用0.3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1ml/100g),剖开腹腔,从腹主动脉采血5ml,采集前禁食12h,分别放于各管中,4℃离心3500rpm,15分钟,分离血清,4℃冰箱保存,送望京医院生化检验室测定总胆固醇、甘油三酯。同时对取下的股骨头制备石蜡切片,进行HE染色,光镜下观察坏死股骨头组织结构的病理变化,并通过图像分析仪对HE染色切片的空骨陷窝率、骨陷窝面积、骨小梁面积进行定量分析；
　　 3.2统计方法
　　 采用SPSS13.0软件数据进行统计分析,组间计量资料数据比较采用单因素方差分析,计量资料数据以均数±标准差((x)±s)表示,P<0.05为有统计学意义。
　　 4研究结果
　　 4.1病理组织学观察
　　 4.1.1 HE染色光镜观察
　　 (1)空白组
　　 ①骨小梁整齐清楚、排列规则、致密饱满。②骨皮质及骨小梁中骨细胞清晰可见,核较大,位于中央,偶可见骨陷窝空虚。③潮线完整,钙化带与软骨下骨小梁连接完好。
　　 ④髓腔内造血细胞丰富,形态正常。软骨下血管较丰富,管径较大的血管壁结构清晰。
　　 ⑤骨小梁边缘成骨细胞数量较多,髓腔中破骨细胞数量较少。
　　 (2)模型组
　　 ①骨小梁稀疏,变细,甚至有断裂现象,结构紊乱,部分有碎片出现。②骨小梁中骨细胞坏死,空骨陷窝数较正常组增多。③髓腔内可见部分脂肪细胞体积增大,有的甚至融合成泡状,造血细胞数量较正常组明显减少。④坏死骨小梁间隙可见有明显纤维肉芽组织增生,在坏死骨小梁周围包绕。⑤骨小梁周围可见少量成骨细胞排列,但数量很少,骨小梁周围无明显新骨沉积性生长。⑥髓腔内多核破骨细胞数量增多。⑦软骨下小血管数量明显减少。⑧潮线明显出现了不延续,有的部分甚至消失。
　　 (3)治疗组
　　 ①骨小梁较模型组变粗,数量明显增多,骨小梁结构大体清晰。②骨小梁中较多正常骨细胞,但仍可见少量坏死骨细胞,空骨陷窝较模型组明显减少。③髓腔内脂肪空泡较模型组减少,造血细胞数量较模型组增多。④成骨细胞数量较模型组增多。⑤髓腔内多核破骨细胞数量较模型组明显减少。⑥软骨下小血管数量较模型组明显增多。
　　 4.1.2图像分析仪定量分析
　　 ①空骨陷窝率:模型组空骨陷窝率增高明显,与治疗组及空白组比较,组间差异显著(P<0.05)；治疗组空骨陷窝率较模型组明显降低,但与空白组比较组间差异仍显著(P<0.05)。
　　 ②骨陷窝面积:模型组骨陷窝面积明显增高,与空白组比较,组间差异显著(P<0.05)；治疗组骨陷窝面积明显降低,与模型组比较,组间差异显著(P<0.05)。
　　 ③骨小梁面积:模型组骨小梁面积明显降低,与空白组比较,组间差异显著(P<0.05)；治疗组骨小梁面积在数值上高于模型组,但是二者组间比较无显著性差异(P>0.05)。
　　 4.2大鼠股骨头组织内VEGF、BMPs、TGFβ1、Ⅷ-R Ag的表达
　　 (1)在VEGF的表达方面:①阳性面积比:治疗组表达高于模型组,且差异显著p<0.05；但治疗组的表达低于空白组,且差异显著p<0.05；②阳性细胞数目比:治疗组表达高于模型组,且差异显著p<0.05；但治疗组的表达低于空白组,差异显著p<0.05。
　　 (2)在BMPs的表达方面:①阳性面积比:治疗组表达高于模型组,且差异显著p<0.05；模型组表达低于空白组,且差异显著p<0.05；②阳性细胞数目比:治疗组表达高于模型组,且差异显著p<0.05；模型组表达低于空白组,且差异显著p<0.05。
　　 (3)在TGF-β1的表达方面:①阳性面积比:治疗组表达高于模型组,且差异显著p<0.05；模型组表达低于空白组差异显著p<0.05；治疗组与空白组比较差异显著p<0.05；②阳性细胞数目比:治疗组表达高于模型组,且差异显著p<0.05,治疗组与空白组比较差异显著p<0.05；模型组表达低于空白组两组间差异显著p<0.05。
　　 (4)Ⅷ-R Ag:微血管密度,治疗组的表达高于模型组,低于空白组,与模型组比较差异显著p<0.05,与空白组比较差异显著p<0.05。
　　 4.3血脂
　　 总胆固醇及甘油三酯水平比较可见,治疗组低于模型组,差异显著p<0.05；模型组高于空白组,差异显著p<0.05。
　　 5结语
　　 在本研究中,我们采用小剂量激素长期应用的方法,在用药的第3周就成功诱导出了激素性股骨头坏死模型,表现为骨髓内脂肪细胞增生、肥大,骨小梁稀疏,空骨陷窝率明显增多,造血细胞数量明显减少,成骨细胞数量明显减少,骨小梁周围无明显新骨沉积性生长,髓腔内多核破骨细胞数量增多,软骨下小血管数量明显减少。
　　 在实验过程中,我们发现激素性股骨头坏死的发生可能与TGFβ1、BMPs、VEGF、的表达下调和新生微血管数量的减少有关；同时发现模型组血清甘油三酯及胆固醇明显升高,脂质代谢紊乱。
　　 脉络宁复合液能通过其活血化瘀、清热解毒、滋阴养血的作用预防及治疗激素性股骨头坏死。该治疗方法不仅能纠正脂肪代谢紊乱,并能上调VEGF、BMPs、TGFβ1、的表达；且该疗法能明显增加坏死股骨头的血供。
　　 6.结论
　　 (1)采用单纯小剂量激素长期应用的方法,可以成功的建立激素性股骨头坏死模型,能较好反应临床激素性股骨头坏死的病理过程。
　　 (2)激素性股骨头坏死的发生与激素所致的脂肪代谢紊乱及组织内骨相关基因蛋白表达改变相关。
　　 (3)通过脉络宁复合液治疗可以使与微血管及骨细胞生成密切相关的生长因子表达上调,促进骨修复,从而治疗激素性股骨头坏死。
　　 (4)运用脉络宁复合液治疗可以改善激素引起的高血脂状况,恢复全身的脂代谢平衡,减少髓腔内的脂肪堆积,有效的降低了骨内压,使坏死区血供增加。
　　 (5)脉络宁注射液具有活血化瘀、滋阴养血、清热解毒的功效。本实验结果说明脉络宁注射液与利多卡因、碳酸氢钠以一定比例配合,在治疗激素性股骨头坏死方面,疗效确切；通过增加与微血管及骨细胞生成密切相关的生长因子的生成,以及改善激素引起的高血脂状态,促进坏死区组织的修复是该疗法的主要治疗机理。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

文献综述

综述一

综述二

参考文献

前言

第一部分 脉络宁复合液治疗大鼠激素性股骨头坏死机理组织形态学的实验研究

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.小结

参考文献

附图

第二部分 脉络宁复合液治疗大鼠激素性股骨头坏死机理的免疫组织化学实验研究

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.小结

参考文献

附图

第三部分 脉络宁复合液治疗大鼠激素性股骨头坏死机理的血脂的实验研究

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

4.小结

参考文献

附录：个人简历

致谢