首乌方对6-OHDA脑内灌流大鼠纹状体细胞外液氨基酸类和胆碱类神经递质的影响

摘要

研究目的及依据
　　 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的老年神经系统退行性疾病,以静止性震颤,肌肉僵硬,运动迟缓和姿势不稳为主要临床症状。在我国60岁以上人群年发病率高达1/1000。伴随社会的老龄化,患病人数还在逐年增多。
　　 中医将PD归属于颤证,认为本病属本虚标实:肝肾阴虚,气血不足为本；风,火,痰,瘀为标。临床常分为肝肾阴虚,气血两虚,血瘀动风,风痰阻络等证型。针对PD的中医病因病机特点,我们选出首乌,天麻、钩藤等药物组成首乌方。首乌方以入肝肾两经的首乌为主药,补益肝肾,强筋壮骨,辅以天麻、钩藤平肝熄风,佐以厚朴下气消痰,共奏补肝肾,益精血,祛风止颤之效,是在中医理论指导下针对PD选出的合理中药处方。本方在临床配合美多芭治疗70例PD患者,总有效率为68.6％,取得了比单用美多芭组(51.4％)更为显著的临床疗效；美多芭用量较对照组减少31.8％。实验研究证实:在利血平所致PD的小鼠模型中本方与美多芭连用可以明显增加脑匀浆中DA的水平。单味药理证明首乌有延缓衰老,抗氧化,改善学习记忆等作用。天麻,钩藤等有抑制血清及过氧化脂生成,增强抗氧化能力的作用。
　　 本实验应用微透析技术,建立脑内灌流6-OHDA所致大鼠纹状体细胞外液氨基酸和胆碱类神经递质变化的模型,采用高效液相-荧光检测和液质联用技术,通过检测清醒自由活动大鼠脑细胞外液天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、牛磺酸(Tau)、γ-氨基丁酸(GABA)以及乙酰胆碱(ACh)的水平,从氨基酸类和胆碱类神经递质的角度,探讨PD的发病机制及美多芭和首乌方的作用机理,以期深入寻找早期干预靶标。
　　 研究方法
　　 1.高效液相(HPLC)-荧光检测(FLD)检测清醒自由活动大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质本实验参考并改进原有文献报道的方法,建立微透析技术与HPLC-FLD相结合的检测清醒自由活动大鼠纹状体细胞外液五种氨基酸类神经递质的方法。应用氨基酸分析柱(Eclipse AAA4.6×150mm,5μm)和邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生化方法。流动相:A液为缓冲液:甲醇:四氢呋喃(V:V:V)=400:95:5；B液为缓冲液:甲醇(V:V)=120:380,二元梯度洗脱。缓冲液为20mM乙酸钠溶液(PH7.2)；确定流速:0.8 mL·min-1；增益:12；分离后的氨基酸衍生化合物用荧光检测器进行检测,激发波长:340 nm,发射波长:455 nm。
　　 2.液质联用(LC-MS/MS)检测清醒自由活动大鼠纹状体细胞外液胆碱类神经递质主要检测清醒自由活动大鼠纹状体细胞外液ACh水平。应用高灵敏度的LC-MS/MS的方法,选用氘代乙酰胆碱(ACh-d9)为内标。色谱条件:色谱柱Atlantis(R)HILIC Silica(2.1×150 mm,3μm)。流动相:A液为25 mM甲酸铵水溶液(pn3),B液为乙腈(0.1％甲酸),A:B(V.V)=18:82；流速:0.4 mL·min-1。质谱条件:ESI离子源,正离子检测方式,选择MRM模式进行二级质谱分析。ACh(m/z):146→87,内标ACh-d9(m/z):155→87,最优碎裂电压(Frag.):90 V。最优碰撞能量(CE):12 V。
　　 3.采用微透析方法在清醒、自由活动状态下,建立脑内灌流6-OHDA所致纹状体细胞外液氨基酸类和胆碱类神经递质变化的大鼠模型6-OHDA是国际学术界公认的制备PD动物模型和细胞模型的神经毒,注射至大鼠纹状体或黑质后,可被DA神经元末梢或胞体的膜转运体主动摄取到细胞内,经氧化生成神经毒性物质如羟自由基和醌类等,使DA神经元变性、死亡,DA递质减少。因6-OHDA引起的病理生化改变与人类PD有较多相似之处,故常用于PD的机制研究和药物筛选。以往的造模方式以脑内注射6-OHDA制作长期PD模型为主,对6-OHDA进入脑内引起的急性损伤变化研究较少。本研究应用微透析技术在大鼠清醒、自由活动状态下,脑内精确灌流0.2％的6-OHDA20μL,造成局部脑区的急性损伤,在造模的同时收集透析液,检测6-OHDA灌流前后纹状体细胞外液中Asp、Glu、Gly、Tau、GABA以及ACh的变化情况。
　　 4.美多芭及首乌方神经保护作用机理的研究
　　 动物分组,给药及微透析过程SD大鼠36只,随机分为对照组、模型组、美多芭高剂量组(100 mg·kg-1)、美多芭低剂量组(33 mg·kg-1)、美多芭低剂量+首乌方组(以上5组均为单次给药)和美多芭低剂量+首乌方2周组(预先首乌方灌胃13天,透析当天灌胃美多芭和最后一次中药),每组6只。戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。立体定位仪定位,于大鼠脑纹状体内(A:+0.2mm,R:+3 mm,V:7.5 mm)埋入探针套管。次日,在清醒自由活动状态下插入微透析探针。用复方氯化钠注射液以2.5μL·min-1的速度灌流,平衡100 min后开始收集透析液,每20 min收集1管。取前4管测定计算均值作为基础水平(0 min)。然后,模型组、美多芭高、低剂量组、美多芭低剂量+首乌方组(单次和长期组)在10min内灌流0.2％的6-OHDA溶液20μL(2％Vit C生理盐水配制),灌流前40min照组和模型组灌胃等量蒸馏水,其余各组灌胃相应药物。共收集透析液320 min。收集到的透析液取出40μL测定氨基酸,10μL加入50μLACh-d9用于ACh的检测。微透析过程见图1(Figl.)。
　　 研究结果
　　 1.建立HPLC-FLD检测清醒大鼠纹状体微透析液中Asp、Glu、Gly、Tau、GABA浓度的方法同日内测定Asp、Glu、Gly、Tau、GABA的混合标准,相对变异系数(RSD)值依次为:Asp:0.77％；Glu:0.52％；Gly:1.65％；Tau:0.97％；GABA:1.57％(n=12)。用250.0、125.0、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0μg·L-1的五种氨基酸混合标准进行测定,线性关系良好,相关系数(r)依次为:Asp:0.9996；Glu:0.9997；Gly:0.9993；Tau:0.9996；GABA:0.9995。清醒大鼠纹状体微透析液中五种氨基酸均有较好的峰高和峰面积响应值标准和透析液的色谱图几乎无杂峰干扰。上述结果说明该方法灵敏可靠。
　　 2.建立LC-MS/MS检测清醒大鼠纹状体微透析液中ACh水平的方法:同日内测定三个浓度:1.460、0.730、0.029μg·L-1的ACh.的标准,RSD值依次为:1.8％,1.9％,7.8％(n=6)。用0.029、0.073、0.146、0.292、0.730、1.460μg·L-1的标准品溶液进行测定,线性关系良好,相关系数(r)为:0.9979。检测限为2.92 ng·L-1。
　　 3.采用微透析方法建立6-OHDA纹状体内灌流所致氨基酸类和胆碱类神经递质变化的模型:模型组6-OHDA溶液灌流后,与对照组相比,Glu有4个时间点GABA有1个时间点,Tau有8个时间点,Gly有2个时间点升高具有显著性差异(P<0.05或<0.01)。ACh在灌流后40min内明显升高,随后下降到对照组水平以下,并持续了320min,在13个时间点显著降低(P<0.05或<0.01)。
　　 4.美多芭对6-OHDA灌流所致大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质和ACh的影响:6-OHDA脑内灌流40 min后,美多芭高、低剂量组与模型组比较分别有5个和4个时间点显著抑制了Glu浓度升高；有7个和2个时间点显著提高了GABA水平(P<0.05或P<0.01)。美多芭组与模型组相比ACh水平无明显差别。
　　 5.首乌方对6-OHDA灌流所致大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质和ACh的影响:美多芭低剂量+首乌方(单次)组与模型组相比有1个时间点Glu水平降低有意义(P<0.01)。预先给予SWF2周组,在6-OHDA灌流160 min后,与模型组和美多芭高、低剂量组相比,Tau分别有7个、9个和3个时间点明显升高(P<0.05或P<0.01)；美多芭低剂量+SWF2周组在40-320 min内ACh浓度均值增高,但无统计学差异。
　　 结论:
　　 本研究连续320 min动态观察了6-OHDA灌流后纹状体细胞外液即刻出现的氨基酸类神经递质、胆碱类神经递质的经时动向,观察了治疗PD的经典药物美多芭及临床治疗有效方剂首乌方对其的作用。研究结果提示:兴奋性、抑制性氨基酸、胆碱类神经递质均可能参与6-OHDA的急性神经毒性机制,美多芭和首乌方对此均有影响,但影响的递质和影响的程度中西药之间有一定差异。本研究为临床有效治疗PD的中西药作用机制提供了部分神经药理学依据。所建立的HPLC-FLD、LC-MS/MS技术检测氨基酸类、胆碱类神经递质的方法灵敏、稳定,可用于清醒自由活动大鼠脑细胞外液微透析样本的检测；应用微透析技术脑内灌流6-OHDA造成的纹状体细胞外液多种神经递质异常的大鼠模型成功,为生理和病理状态下脑内多种神经递质的研究提供了可用的方法,对进一步探索PD发病机制、筛选PD早期干预的药物有意义。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

文献综述

1.前言

2.材料和方法

2.1 动物

2.2 试剂和药品

2.3 仪器

2.4 动物分组,给药及微透析

2.5 HPLC-FLD分析

2.6 HPLC-MS/MS分析

2.7 统计学处理

3.结果

3.1 建立HPLC-FLD检测清醒大鼠纹状体细胞外液氨基酸含量的方法

3.2 建立LC-MS/MS检测清醒大鼠纹状体细胞外液ACh的方法

3.3 脑内灌流6-OHDA所致大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质和ACh水平的变化

3.4 美多芭对6-OHDA灌流所致大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质和ACh的影响

3.5 首乌方对6-OHDA灌流所致大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质和ACh的影响

4.讨论

4.1 氨基酸测定方法学评价

4.2 ACh测定方法学评价

4.3 动物模型评价

4.4 美多芭对模型大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质和ACh影响的作用机制

4.5 首乌方对模型大鼠纹状体细胞外液氨基酸类神经递质和ACh影响的作用机制

参考文献

致谢