类风湿性关节炎寒热证候分类的系统生物学基础

摘要

本研究首先以类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)为例,利用多元统计分析方法,分析了临床随机对照试验的结果,我们发现:借助因子分析可确定RA的寒热证候分类,同时寒热证候分类与中西药干预方法的疗效相关,且证候的变化也会影响疗效的改变,说明中医寒热证候分类在RA治疗方法的选择上具有指导价值。虽然RA寒热证候分类的依据主要是中医相关症状,但其对疗效的影响说明RA寒热证候具有特定的生物学基础。
　　 进而,以类风湿性关节炎为范例,选取临床典型的RA寒、热证患者病例,采用系统生物学思路与方法(基因组学及代谢组学),探索RA寒热证候的内在生物学特征,期望能丰富中医证候理论的科学内涵,同时为类风湿性关节炎临床诊断和有效治疗提供理论工具。
　　 1目的
　　 分析RA寒热证候分类对中西药治疗方法疗效的影响,并通过检测类风湿性关节炎典型寒、热证CD4+T淋巴细胞基因表达谱及血浆代谢谱,研究寒热证候的生物学差异,探讨类风湿性关节炎寒热证候分类的科学基础。
　　 2研究对象和方法
　　 研究思路:利用多元统计分析方法,分析中西药治疗RA随机对照临床数据,探索中医寒热证候分类与疗效的关系；在此基础上,随机选取符合纳入标准的RA女性患者,参照相应标准进行寒、热证候辨别。取患者CD4+T淋巴细胞及血浆,进行基因表达谱及代谢组学测定,寻找类风湿性关节炎寒热证候之间差异表达的基因及生物标记物,并对结果进行生物信息学分析,探寻类风湿性关节炎寒热证候差异的生物学基础。
　　 3研究内容
　　 3.1临床数据分析
　　 数据来源:国家“十五”攻关项目全国9个临床中心RA临床随机对照试验数据。
　　 分析方法:采用回归分析、主成分分析、因子分析、辨别分析、聚类分析等多元统计方法,探索RA证候分类及各证候类型与临床疗效的相关关系。
　　 3.2实验研究
　　 基因表达谱研究:随机选取北京中日友好医院女性患者20例,年龄12-68岁。纳入病例中寒证患者为10例,热证患者为10例。
　　 代谢组学研究:随机选取北京中日友好医院女性患者21例,纳入病例中寒证患者为15例,热证患者为6例；另选取16例女性为正常对照组(依据体检结果排除了感染、炎症等影响因素)。
　　 ◇病例纳入标准:疾病诊断、病情进展分类标准:参照1987年美国风湿病学会(ARA)修订的诊断标准。
　　 ◇证候诊断标准:参照1993年卫生部《中药新药治疗痹病的临床研究指导原则》、1994年国家中医药管理局发布的《中医病证诊断疗效标准·旭痹的诊断依据、证候分类、疗效评定》、1997年中华人民共和国国家标准《中医临床诊疗术语证候部分》和1988年全国中西医结合风湿类疾病学术会议拟订的诊断标准。
　　 ◇排除标准:合并严重关节外表现,如高热不退、多发类风湿结节、肺间质纤维化、肾脏淀粉样变、缩窄性心包炎、血管炎等需要使用糖皮质激素的患者；长期服用有关治疗RA的慢作用药物,且在本研究前至少1周内未停用甲氨喋呤、氯喹、柳氮磺胺吡啶、环磷酰胺、青霉胺和金制剂等免疫抑制类药物的患者；合并有循环、呼吸、消化、泌尿生殖、造血系统以及中枢神经系统等严重疾病的患者。
　　 4研究方法
　　 4.1基因表达谱研究
　　 ◇CD4+T淋巴细胞分离纯化:采集空腹静脉血,EDTA抗凝,加入CD4+T细胞富集抗体混匀,Ficoll淋巴细胞分离液分离,PBS溶液洗两遍,离心即可得到纯度90％以上的CD4+T淋巴细胞。
　　 ◇芯片杂交前RNA预处理:按TRIzol说明书,提取细胞总RNA,并进行PNA质检；依据QIAGEN RNeasy(R)Kit操作手册纯化总RNA；一步法合成cDNA链；aaUTP标记合成cRNA；QIAGEN RNeasy Mini Kit纯化cRNA并对其质控测定；cRNA荧光标记并纯化
　　 ◇芯片杂交及检测:芯片为Agilent人类全基因组芯片(4*44k),所有芯片均以相同对照标记为Cy3,样本标记为Cy5。cRNA样品片段化后与芯片杂交,洗涤后Agilent扫描仪扫描得到基因表达谱原始数据。
　　 ◇芯片数据分析:分析Agilent软件导出数据,取各芯片中位数比值进行对数转换,然后用SAS的标准化程序进行均值为0标准差为1的标准化操作；采用SAS的MI Procedure过程对标准化后的数据进行缺失值填补；以alpha=0.05为置信度,对缺失值填补后的数据进行t检验,选择有显著性差异的基因；采用SAS的Power Procedure对有显著性差异的基因过程进行把握度计算,保留Power>0.85的基因；以Ratio>2或Ratio<0.5为显著性差异界限,计算寒热证差异基因的比值,筛选寒热差异表达基因。借助BIND、DIP、HPRD、IntAct及MINT等数据库对差异表达基因进行蛋白质相互作用网络分析；IPCA运算法则寻找网络高联接区并借助BINGO工具对高联接区进行GO功能分析。
　　 4.2代谢组学研究
　　 ◇血浆处理:EDTA抗凝管收集外周血,离心取血浆冻存备用。分析前超低温冰箱取出,充分溶解震荡,加入乙腈高速离心取上清,加入内标液充分溶解,离心取上清自动取样器取样分析。
　　 ◇样品检测:自动加样器(Agilent7683系列)加到Agilent6890气相色谱；色谱柱规格:30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm DB5-MS熔融石英毛细管柱；喷头温度设定为290℃；载气:氦气,35cm/秒；柱温:起始温度100℃,以2.5℃/min速率增加至285℃,持续6 min；传输器温度设定为285℃；传输器温度设定为285℃；离子源温度设定为200℃；数据采集范围m/z40-500；GC/MS(岛津)定性分析。
　　 ◇数据分析:数据主要采用Par scaling的方法对所有数据集的变量进行数据尺度同一化处理,采用软件包(SIMCA-P version11.0)对原始信息进行主成分分析；偏最小二乘法显著性分析用来找寻能区分RA寒热证候贡献度最大变量。运用质谱确定最大贡献度变量的代谢物结构,交叉验证测试用来确认PLS-DA模型的可靠性。
　　 5结果
　　 5.1临床数据分析
　　 ◇西药方案在治疗RA寒热患者过程中,3个月及6个月的疗效均以寒证组为高,具有统计学意义。
　　 ◇在患者证候类型变化的情况下,无论中医组及西医组方案其临床疗效均发生显著性改变。
　　 5.2基因表达谱
　　 ◇类风湿性关节炎寒热证候之间有29个差异基因表达,其中7个基因在寒证高表达:LPAAT-THETA、COL6A1、ENST00000256367、THC2318696、SPECC1、TLR4、及THC2312748；22个基因在热证高表达:LOC400509、BF210146、CABLES1、APOA1、CD614215、IGHD、SPP1、WWOX等。
　　 ◇利用ICPA运算法则查找差异基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络,发现4个高联接区,GO功能分析发现寒证与toll样受体信号通路有关,而钙离子信号通路、细胞粘附分子、PPAR信号通路以及脂肪酸代谢途径与热证相关联。
　　 ◇生物信息学分析结果表明:类风湿性关节炎寒热证患者表现为凋亡及炎症的不同调控机制。
　　 5.3代谢组学
　　 ◇类风湿性关节炎患者与正常对照组、类风湿性关节炎寒热证候之间均存在代谢物谱差异,PLS-DA得分图显示RA与正常对照,RA寒证与热证之间根据代谢谱数据能够清晰分开。
　　 ◇PCA、PLS-DA结合质谱方法,找到类风湿性关节炎寒热证候差异的7个潜在生物标记物:3-氧-丙酸(3.Oxy propanoic acid)、L-脯氨酸(L-Proline)、尿素(Urea)、5-氧-脯氨酸(5-Oxo-proline)、核糖醇(Ribitol)、纤维醇(Inositol)、L-亮氨酸(L-Leucine)。其中前6个标记物为热证上调,L-亮氨酸为寒证上调。
　　 ◇对这些生物标记物进行功能检索分析提示:与寒证相比,热证患者机体存在过多的胶原分解；而寒证患者机体蛋白质合成过程大于蛋白质分解。
　　 6结论
　　 6.1 RA寒热证候分类与中西药临床干预方案疗效相关,且证候的变化也会影响临床疗效的改变,RA中医证候分类在临床治疗方案选择上具有指导意义。
　　 6.2类风湿性关节炎寒热证候存在生物学差异,应用基因表达谱方法及代谢组学技术能够检测出RA寒热证候差异相关的基因表达及生物标记物。
　　 6.3生物信息学分析发现RA寒热证候存在对凋亡、蛋白质代谢等不同的调控机制,对这些机制的深入了解可帮助理解不同证候临床疗效的差异,可为指导临床合理治疗方案提供理论依据。
　　 6.4基因表达谱及代谢组结果均提示RA寒热证表现炎症的不同调控,说明系统生物学技术和方法用于中医证候研究稳定可靠,能够为深入理解复杂证候理论提供技术平台。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

文献综述:代谢组学研究及其在中医药的应用

1 代谢组学及其发展历史

2 代谢组学与其他组学的联系及比较

3 研究对象和内容

4 研究方法

5 代谢组学研究的应用

6 代谢组学在现代中医药研究中的应用

7 展望

参考文献

前言

研究内容

第一章 类风湿性关节炎寒热证候临床数据分析

1 类风湿性关节炎症状因子分析

2 类风湿性关节炎寒热证候属性对临床疗效的影响

3 类风湿性关节炎寒热证候改变对临床疗效的影响

4 类风湿性关节炎寒热证候与临床检测指标的关联

5 小结

第二章 实验研究

实验一 类风湿性关节炎寒热证候基因表达谱研究

实验二 类风湿性关节炎寒热证候代谢组学研究

结论

参考文献

个人简历

致谢

附中医药科研项目查新报告书