IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价

摘要

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变和（或）粪便性状改变的功能性肠病，该病缺乏可解释症状的形态学改变和生化异常，其患病率逐年增高，与精神心理因素和感染因素密切相关。腹泻型肠易激综合征(IBS-D)是我国IBS最常见的类型，其发病机制复杂，包括内脏感觉过敏、肠道动力增强、脑肠作用异常、神经-内分泌-免疫网络异常等。近年来对IBS-D发病机制的研究逐渐深入到了分子水平，但还比较片面。中医学认为肝郁脾虚是其基本病机，肝郁脾虚证是其最主要的证型。西药作用靶点单一，难以解决IBS-D复杂的临床症状，中药复方具有多靶点作用整体治疗的优势。目前对IBS-D动物模型的研究尚处于探索阶段，其造模方法还不成熟，动物模型稳定性欠佳，深入全面研究IBS-D的发病机制需要建立一种稳定的重复性好的动物模型。进一步建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合动物模型有利于研究中药复方的作用机理，对于开发新药，发挥中医药治疗IBS-D的优势具有推动作用。
　　 第一部分:IBS-D大鼠模型制作方法的探索
　　 目的:探索建立IBS-D大鼠模型的理想制作方法
　　 材料和方法:本部分研究采用新生雌性SD大鼠造模，分为正常对照组、番泻叶高剂量组、中剂量组、低剂量组、高乳糖饲料组、醋酸灌肠组和5-HT腹腔注射组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠采用新生期母子分离法建立内脏高敏感模型，即出生后第2-14天，每天与母鼠分离3h，2月后选择体重大于250g的大鼠进行致泻造模。番泻叶高剂量组给予番泻叶煎剂4.5g/kg、中剂量组给予3g/kg、低剂量组给予2g/kg灌胃，灌胃体积为10ml/kg，连续7天，给予普通饲料喂养:高乳糖组采用高乳糖饲料喂养，7天后换用普通饲料;醋酸灌肠组给予4％的醋酸灌肠1ml，灌肠1次，普通饲料喂养，此后不做任何处理;5-HT腹腔注射组给予5-HT2.1mg/kg腹腔注射，连续7天，普通饲料喂养;正常组不给于任何处理。观察各组大鼠造模期间的腹泻率，造模后1周每天的大便积分（硬便1分，软便2分，不成形便3分），造模前后的体重增长情况以及近端结肠的病理组织学变化。
　　 结果:(1)腹泻率:番泻叶高剂量组(4.5g/kg)、高乳糖饲料组和醋酸灌肠组大鼠腹泻率均为100％，其余各组均未出现腹泻。(2)体重增长量:与正常组大鼠相比，除番泻叶低剂量组大鼠体重无明显变化外，其余各组体重增长量均显著降低，具有显著性差异(P＜0.01)，其中高乳糖饲料组和醋酸灌肠组大鼠体重出现明显的负增长。(3)大便积分:造模后番泻叶高剂量组和醋酸灌肠组大鼠6天内的平均大便积分显著高于正常组，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。(4)近端结肠病理:高乳糖组可见淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润，细胞间质轻度水肿;醋酸灌肠组部分结肠与腹腔组织粘连、增厚，结肠缩短，近端结肠可见粘膜轻度充血，绒毛变钝，其余各组未见异常。
　　 结论:(1)母子分离+适当剂量的番泻叶灌胃是复制IBS-D动物模型较为合理的造模方法。(2)基于大便基本特征和病理组织学改变是判定IBS-D动物模型是否成功的重要依据之一。
　　 第二部分:IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价
　　 目的:建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型。
　　 材料和方法:本部分研究采用新生SD雄性大鼠造模，分为正常组、正常束缚组、母子分离组、分离+束缚组（模型组）和以方测证组，每组20只大鼠。基于第一部分研究结论选择母子分离+番泻叶灌胃复制IBS-D大鼠模型，采用慢性束缚应激复制肝郁脾虚证候模型，将二者叠加建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型。分三步造模，第一步:正常组和正常束缚组大鼠新生期母子不分离，其余各组于出生后第2-14天，每天与母鼠分离3h;第二步:各组大鼠2月龄时，正常组和母子分离组不处理，其余各组采用自制束缚架，束缚肩部和腹部，使其固定不动，每天束缚3h，连续3周;第三步:束缚造模期第2周开始每天上午9点给予以方测证组大鼠灌服痛泻要方煎剂（3g/kg，10ml/kg），其余各组灌服生理盐水(10ml/kg)，第3周开始，正常束缚组、母子分离组和模型组每天上午9点灌服生理盐水，下午4点灌服番泻叶煎剂(4.5g/kg，10ml/kg)，乙方测证组上午灌服痛泻要方煎剂，下午灌服番泻叶煎剂，正常对照组上下午均灌服生理盐水。从宏观疾病特征、宏观证候特征和微观生物学指标三个方面对模型进行评价。宏观疾病特征评价方法:束缚造模前后检测各组大鼠的内脏敏感性（痛觉阈值）、测评束缚期间和造模后各组大鼠的大便积分（计分方法同前）。宏观证候特征评价方法:肝郁的评价于束缚造模期前后观察各组大鼠旷场行为学、糖水偏好率、悬尾不动时间，脾虚的评价通过观察各组大鼠在束缚期间的体重增长情况以及造模后的进食量。微观生物学指标评价:检测血清D-木糖、5-HT、BDNF、IgA、IgG含量;采用流式细胞仪分析血液和胸腺组织的T淋巴细胞亚群分布，比较各组大鼠的脾脏指数;采用免疫组织化学的方法检测近端结肠和末端回肠组织中的肥大细胞和嗜铬细胞数目变化;评价近端结肠和末端回肠的病理组织学变化。
　　 结果:(1)痛觉阈值:造模结束后，母子分离组和模型组大鼠痛觉阈值较正常组明显降低（均P＜0.01），正常束缚组痛觉阈值与正常组无显著性差异，痛泻要方可提高模型组大鼠的痛觉阈值(P＜0.01)。(2)大便情况:短期束缚应激可使大鼠排便粒数明显增加，长期束缚应激对大鼠排便粒数无明显影响，但可使其大便含水量增加，甚至不成形。造模结束后，5天内的平均大便积分模型组显著高于正常组、正常束缚组和母子分离组（均P＜0.01），痛泻要方对模型组大鼠的腹泻情况无明显改善。(3)体重增长量:造模结束后，正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠的体重增长量均较正常组降低（均P＜0.01），痛泻要方对模型组大鼠的体重无明显影响。(4)旷场实验:造模结束后，正常束缚组、母子分离组、模型组大鼠的穿格数和站立数均较正常组减少（均P＜0.05），痛泻要方可提高模型组大鼠的穿格数和站立数(P＜0.05)。(5)糖水偏好率:造模结束后，正常束缚组、母子分离组和模型组的糖水偏好率均较正常组降低(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)，痛泻要方可提高模型组大鼠的糖水偏好率(P＜0.05)。(6)悬尾不动时间:造模结束后，正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠的悬尾不动时间较正常组延长(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)，痛泻要方可缩短模型组大鼠的悬尾不动时间(P＜0.05)。(7)进食量:造模后正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠平均进食量与正常组比较无明显变化，痛泻要方可提高模型组的进食量(P＜0.05)。(8)血清指标:造模结束后，血清D-木糖含量正常束缚组、母子分离组和模型组较正常组明显降低（均P＜0.01），痛泻要方对模型组大鼠的血清D-木糖含量无明显影响。血清5-HT正常束缚组与正常组比较无显著性差异，母子分离组和模型组较正常组升高（均P＜0.01），痛泻要方可降低模型组大鼠的血清5-HT含量(P＜0.01)。血清BDNF各组之间无显著性差异。血清IgA母子分离组和模型组较正常组升高（均P＜0.05），正常束缚组和正常组无显著性差异;痛泻要方对模型组大鼠血清IgA水平无明显影响。血清IgG母子分离组和模型组与正常组无显著性差异，痛泻要方对模型组血清IgG无明显影响。(9)T淋巴细胞亚群比例:造模结束后，血液Th(CD3+CD4+CD8-)亚群比例正常束缚组、母子分离组和模型组较正常组升高（均P＜0.05），Tc(CD3+CD4-CD8+)亚群比例较正常组降低（均P＜0.01），胸腺T总细胞比例较正常组升高（均P＜0.05），痛泻要方对模型组的血液和胸腺T淋巴细胞亚群比例无明显影响。(10)脾脏指数:母子分离组和模型组较正常组降低（均P＜0.01），正常束缚组和正常组无显著性差异，痛泻要方对模型组脾脏指数无明显影响。(11)近端结肠肥大细胞数目:模型组较正常组增多(P＜0.01)，正常束缚组和母子分离组与正常组无显著性差异，痛泻要方可显著减少模型组大鼠近端结肠的肥大细胞数目(P＜0.01)。(12)嗜铬细胞数目:正常束缚组、母子分离组和模型组近端结肠和末端回肠中的肥大细胞数目均较正常组增多（均P＜0.01），痛泻要方对模型组大鼠近端结肠组织中的嗜铬细胞数目无明显影响。(13)组织病理:各组大鼠近端结肠和末端回肠病理检查未见明显异常。
　　 结论:(1)采用母子分离+慢性束缚应激+番泻叶灌胃可成功建立IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型。(2)采用慢性束缚联合母子分离法造模优于单一因素法。(3)本研究所建立的IBS-D肝郁脾虚型大鼠模型具有内脏高敏感性、肠道通透性增加、抑郁和免疫功能异常等多种特征。(4)根据IBS-D肝郁脾虚证患者的宏观疾病、证候特征和微观生物学指标评价动物模型是否成功的方法科学、合理，具有可行性。
　　 第三部分:IBS-D肝郁脾虚型大鼠模型结肠和脑的蛋白质组学研究
　　 目的:基于第二部分大鼠模型，从结肠和脑组织中筛选和鉴定与IBS-D发病相关的差异蛋白，并进行对比分析。
　　 材料和方法:采用第二部分正常组、正常束缚组、母子分离组和模型组大鼠的近端和远端结肠和全脑组织样本进行蛋白质组学分析。利用iTRAQ技术筛选各组样本中的差异蛋白，采用Mascot软件对差异蛋白的质谱信息进行鉴定和定量分析，然后基于Uniprot和Gene Ontology数据库对鉴定到的差异蛋白进行功能注释，采用IPA软件分析各组差异蛋白涉及到的生物通路和相互作用关系。并采用实时荧光定量RT-PCR技术从基因水平对选定差异蛋白进行验证。
　　 结果:(1)与正常组比较，在正常束缚组大鼠结肠组织中筛选和鉴定出了542个差异表达蛋白（差异倍数＞1.2，P＜0.05），其中309个上调，233个下调，脑组织中筛选和鉴定出了1884个差异蛋白，其中764个上调，1120个下调;母子分离组结肠组织中筛选和鉴定出了809个蛋白，其中415个上调，394个下调，脑组织筛选和鉴定出了2386个蛋白，其中1080个上调，1306个下调;模型组结肠组织中筛选和鉴定出了731个差异蛋白，其中424个上调，307个下调，脑组织中筛选和鉴定出了2567个差异蛋白，其中1187个上调，1380个下调。(2)正常束缚组、母子分离组和分离束缚组在结肠组织中有192个差异蛋白共同表达，在脑组织中有1501个差异蛋白共同表达。(3)在正常束缚组，有153个差异蛋白在脑和肠组织共同表达，母子分离组有280个差异蛋白在脑和肠组织共同表达，分离束缚组有239个蛋白在脑和肠组织中共同表达。三组均有55个差异蛋白在脑和肠组织中共同表达。(4)模型组结肠组织中差异倍数＞3蛋白有6个，其中4个上调:S腺苷甲硫氨酸脱羧酶酶原、内凝集素蛋白、FH2区包含蛋白1、主要组织相溶性复合体Ⅱ类抗原;2个下调:磷脂酰肌醇特异的磷脂酶CX区包含蛋白3、血红蛋白α亚。这些蛋白主要参与了S腺苷甲硫氨酸合成、信号转导、肌动蛋白细胞骨架组装、免疫反应、脂质代谢、氧气转运过程。脑组织中差异倍数＞4的蛋白有22个，其中4个上调:过氧化物酶膜蛋白PEX14、NADH泛醌氧化还原酶链2、唐氏综合症临界区域基因3、Lrba蛋白;18个下调:血红蛋白β亚基、胸腺旁腺素、神经生长因子、细胞色素C氧化酶6B1亚基、40s核糖体蛋白、ATP合成酶d亚基、线粒体输入内膜移位酶亚基Tim13、NADH脱氢酶黄素蛋白3、细胞色素C氧化酶5A亚基、浦肯野细胞蛋白4、ATP合酶藕联因子6、脂酰辅酶A结合蛋白、细胞色素C、金属硫蛋白3、肌动蛋白相互作用蛋白1、泛醌细胞色素C还原酶结合蛋白、甘油醛3磷酸脱氢酶、胸腺素β4。这些蛋白参与了蛋白质运输、电子传递、空泡运输、氧气转运、免疫、神经内分泌、rRNA转运、金属离子结合、肌动蛋白细胞骨架组装、核苷酸代谢等。在模型组肠组织中鉴定出的热休克蛋白27、免疫球蛋白J链表达上调、血红蛋白α亚基、血红蛋白β亚基表达下调，这些蛋白与临床报道一致。(5)模型组结肠组织的差异蛋白功能主要与细胞组织结构、细胞的功能和修复、细胞死亡和生存、细胞形态、组织发育、细胞发育、细胞的生长和增殖、神经系统发育和功能、细胞与细胞的信号传导和相互作用、小分子生物化学等有关，脑组织的差异蛋白功能主要与细胞的组织结构、细胞的功能和修复、细胞死亡和生存、细胞形态、小分子生物化学、神经系统发育和功能、小分子转运、细胞发育、组织发育和核苷酸代谢等有关。(6)模型组大鼠结肠组织中的差异蛋白主要涉及了整合素信号、5-HT降解信号、抗原呈递通路、白介素4信号等27个生物通路，脑组织的差异蛋白主要涉及了间隙连接信号、上皮黏着连接信号、线粒体功能障碍等26个生物通路。结肠组织中存在9类差异蛋白相互作用网络，脑组织中存在12类差异蛋白相互作用网络。(7)结肠组织AQP8mRNA、NHE3mRNA表达水平与蛋白表达水平一致，结肠和海马BDNFmRNA表达与蛋白表达水平不完全一致。
　　 结论:(1) IBS-D肝郁脾虚证大鼠模型结肠和脑组织中存在大量差异表达的蛋白，部分蛋白与临床报道一致，该模型具备IBS-D的病理特征。(2) IBS-D肝郁脾虚证大鼠模型结肠和脑组织中存在大量共同表达的差异蛋白，表达方式多样，印证了IBS-D脑肠相互作用异常的机制。(3)慢性束缚应激、母子分离应激以及二者联合作用具有共同的分子生物学基础，二者联合对脑组织差异蛋白表达的影响具有协同作用。(4) IBS-D发病与多种蛋白质分子改变有关，深入研究各差异蛋白的功能可进一步阐明IBS-D的发病机制。

目录

声明

摘要

英文缩略语

综述一 IBS-D危险因素及其发病机制研究进展

1 IBS-D危险因素研究进展

2 IBS-D的发病机制研究进展

3 小结与展望

综述二 IBS-D的病因病机及辨证分型研究现状

1 IBS-D的病因病机

2 IBS-D的证候分类挖掘分析

3 小结与展望

综述三 IBS-D动物模型的国内外研究现状

1 IBS动物模型研究现状

2 IBS-D动物模型研究现状

3 IBS-D病证结合动物模型研究现状

4 小结及展望

研究背景

第一部分 腹泻型肠易激综合征大鼠模型制作方法的探索

前言

材料

1 实验动物

2 实验药物及试剂

方法

1 动物分组

2 模型制备方法

3 模型评价指标

4 统计学方法

结果

1 一般状态观察

2 体重增长情况

3 腹泻率及大便积分

4 结肠病理组织学改变

讨论

结论

参考文献

第二部分 IBS-D肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的建立与评价

前言

材料

1 实验动物

2 实验药物及试剂

3 主要实验仪器

方法

1 动物分组及给药方法

2 模型制备方法

3 模型疾病特征的评价

4 模型证候特征的评价

5 生物学指标评价

6 统计分析方法

结果

1 一般状态观察

2 内脏敏感性

3 腹泻情况及大便积分

4 体重增长情况

5 旷场实验结果

6 糖水偏好实验结果

7 悬尾实验结果

8 进食量

9 血清指标变化

10 血液和胸腺T淋巴细胞亚群分析

11 脾脏指数

12 肠组织肥大细胞、嗜铬细胞数分布

13 结肠病理组织观察

讨论

结论

参考文献

第三部分 IBS-D肝郁脾虚证大鼠模型结肠和脑的蛋白质组学研究

前言

材料

1 实验材料

2 主要实验试剂

3 实验仪器及软件

方法

1 差异蛋白的筛选与鉴定

2 差异蛋白的基因水平验证

3 统计学方法

结果

1 蛋白质提取结果

2 差异蛋白定性分析结果

3 差异蛋白定量分析结果

4 同一组织差异蛋白的表达情况

5 各组结肠和脑组织共有的差异蛋白表达情况

6 组间脑和肠组织共有的差异蛋白表达情况

7 差异蛋白功能聚类

8 差异蛋白所涉及的生物通路及相互作用关系

9 差异蛋白的基因水平验证结果

讨论

结论

参考文献

总结与展望

致谢

个人简历

附录一 正常束缚组(B)脑和肠组织中共有的差异蛋白及其功能(差异倍数≥1．5)(C：肠组织，N：脑组织)

附录二 母子分离(G组)脑和肠组织中共有的差异蛋白及其功能(差异倍数≥1．5)

附录三 分离束缚组(D)脑和肠组织中共有的差异蛋白及其功能(差异倍数≥1．5)

附录四 组间脑和肠共有的差异蛋白及其功能(差异倍数≥2)

附录五 组间结肠组织共有的差异蛋白及其功能(差异倍数≥2)

附录六 组间脑组织共有的差异蛋白及其功能(差异倍数≥3)

附录七 查新报告