抗类风湿性关节炎滑膜血管新生的中药药效评价方法研究

摘要

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性滑膜炎并侵蚀软骨、最终导致骨与关节破坏为特征的世界难治性自身免疫性疾病。其发病率较高，世界约0.5～1％、我国约0.32～0.36％，致残率也高，给社会和家庭带来严重的负担。RA的发病机制至今尚未完全阐明，也无特效疗法。已知新生血管形成伴随着滑膜增生和炎性细胞浸润，是RA血管翳形成及关节破坏的基础。临床研究发现RA关节内新生血管增生的程度与患者的病情、滑膜增生及炎细胞浸润的程度成正相关，通过抑制血管生成的药物可以缓解RA的病情。因此，延缓甚至阻断RA病人的滑膜血管新生已成为当前国际RA治疗的有效策略之一。
　　RA既属中医的痹症范畴，也属中医的络病范畴，其病机与络脉痹阻相关，为“毒损肢节络脉、络道亢变、络脉虚滞”，这与RA的“滑膜炎症-血管新生-损伤”的现代病机特点相似。现代研究认为RA络病的实质与滑膜血管新生有关。中医临床研究显示，具祛风胜湿、活血化瘀、虫类搜风等“通络开痹”功效的中药具有较好的抗RA滑膜血管新生作用。提示从中药宝库中开发具有抑制血管新生作用的抗风湿改善病情药物(DMARDs)的可能。然而目前国内外均未建立适合中药整体作用特点的抗RA滑膜血管新生药效机理评价方法，严重影响了具有抗RA滑膜血管新生作用的中药新药的研发，使其国际化进程受到限制。因此，积极探索和建立适合中医药的抗RA滑膜血管新生的药效学评价方法是当前中医药治疗RA研究中的重要课题。
　　本研究针对RA的病因病机特点以及滑膜血管形成的病理机制，从RA单纯疾病模型胶原诱导性关节炎(CIA)模型、RA病证结合模型(风寒湿证和风湿热证)、细胞模型等方面，通过药效评价、机理探讨、检测分析，构建了抗RA滑膜血管新生的中药药效评价模型。并选择雷公藤甲素、通络开痹中药复方(清络饮和温络饮)和抗RA寒证经典方剂(乌头汤)作为干预，较好地探索了所建立的药效评价方法的合理性和规范性。本研究所建立的抗RA滑膜血管新生的中药药效评价方法和模式，为其他同类中药药效评价方法的构建提供有意义的参考。
　　中药药效评价是中药研究的难点。本研究建立的评价方法还有很多不足，有待进一步完善，如：没有建立SCID-HuRAg嵌合体等可供动态观察滑膜血管新生过程的整体动物模型以及血管内皮细胞和RA滑膜成纤维细胞(RA-HFLS)共培育诱导滑膜血管生成过程的体外细胞模型。另外，所建立病证结合模型尚处于探索阶段，如风寒湿或风湿热等刺激因素的诱导能否直接导致与临床RA风寒湿证或风湿热证相同病理变化的产生等等，需要更深层次的研究。中药整体调节作用与现代的组学、系统生物学和网络药理学的系统特性相似，下一步可从网络药理学的角度进行相关研究。
　　具体研究内容如下：
　　1抗RA滑膜血管新生中药药效评价模型建立。
　　本研究中，我们分别采用CIA敏感品系DA大鼠和非敏感品系SD大鼠成功复制了能反映RA I}缶床症状和滑膜血管新生病变的CIA，其中采用DA大鼠的造模成功率100％，SD大鼠的造模成功率87.5％，但与SD大鼠相比，DA大鼠价格昂贵来源极少，故价廉易得的SD大鼠能大大降低抗RA新药研发的成本，同样适合于抗RA的药物活性筛选，而且更适合于大规模的复制。
　　方证对应是中药发挥疗效前提，需要采用中医证的模型才能较好地评价中药疗效。本研究在RA单纯疾病模型CIA的基础上，给予动物一定的风寒湿或风湿热条件干预，模拟中医临床“风、寒、热、湿”等多种病因夹杂致病特点和“毒损络脉”的病机特点，分别制作出RA的寒(风湿)证与热(风湿)证模型，并根据中医动物模型拟临床主观症状客观化的研究思路，从关节表面温度、关节疼痛阈值、关节表面血流速度、全血粘度等这些符合中医证型临床客观指标作为主要评判标准，建立针对模型寒热证候特点的客观评价指标体系。结果显示，模拟病因制作的RA寒(风湿)证与热(风湿)证动物模型，既有明显的寒/热证症状，又有明显的RA特征。
　　针对滑膜血管形成的病理机制，我们建立了抗RA滑膜血管新生的体内体外活性筛选模型，以便从深层次阐明药物的作用靶点。包括：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖、迁移、黏附和管腔形成实验，RA-HFLS的增殖、迁移和黏附实验；体内单纯血管生成模型--小鼠基质胶栓实验。其中，RA=HFLS携带RA滑膜炎症反应特有的遗传信息，结合HUVEC能反映RA炎症反应对血管新生的影响。
　　2抗RA滑膜血管新生药效评价指标建立。
　　从关节红肿、畸形等临床症状观察、临床积分、发病率、肿胀度、首次发病时间、关节滑膜组织炎性增生和炎症细胞浸润程度以及由其介导的关节损伤程度(关节组织病理学检查和影像学技术)等方面评价RA药效；通过关节滑膜组织血管新生情况(常规病理和血管内皮细胞标志物CD31的免疫组化技术)和基质胶子中血管生成情况(组织病理学检查)评价血管新生病变程度，从而建立抗RA滑膜血管新生药效评价指标体。
　　3基于血管形成过程的抗RA滑膜血管新生作用机理评价指标建立。
　　针对滑膜血管形成的复杂过程和调控机制，观察了体外培养的m.WEC和RA-HFLS的增殖、迁移、黏附和管腔形成能力，同时观察了体外和/或体内血管新生的调控通路VEGF/VEGFR和Ang/Tie2及炎症相关调控因子表达情况，从而构建抗RA滑膜血管新生的药物作用机理评价指标。
　　4抗RA滑膜血管新生中药药效评价方法的验证。
　　以传统抗RA中药雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素为验证对象，通过CIA大鼠关节炎红肿症状表现、临床积分和发病率以及病理学检查考察对RA的疗效，采用组织病理学HE染色和CD31特染方法考察对滑膜血管新生的作用，并通过考察体外HUVEC和RA-HFLS的增殖、迁移、黏附和管腔形成能力及血管新生调控通路因子的表达情况进行机理探讨，结果显示雷公藤甲素具有抑制RA滑膜血管新生的作用。通过雷公藤甲素比较全面的验证，证明了所建立评价方法的规范性和合理性。
　　从RA“络病”与血管增生的关系入手，通过具有“通络”作用的寒、温属性不同的复方清络饮、温络饮对大鼠CIA、小鼠基质胶栓模型和体外RA-HFLS和HUVEC实验及相关药效和机理评价指标的验证，结果显示清络饮抑制RA滑膜血管新生的作用优于温络饮，初步提示CIA可能具有RA脉络瘀阻证的生物学表征，可能更适合于具有中医治则治法的寒性中药研究。
　　辨证论治是中医药发挥疗效的前提。以CIA疾病模型为对照，通过抗RA寒痹证经典方剂乌头汤对RA寒(风湿)证的“对证”和RA热(风湿)证的“不对证”的验证，考察所建RA寒(风湿)证和热(风湿)证模型的合理性和可靠性，结果显示乌头汤治疗RA寒(风湿)证滑膜血管新生的作用优于CIA，对热(风湿)证模型没有明显作用，初步提示RA寒(风湿)证模型可能一定程度地反映RA寒证证候特征，适合于具有明显热性中药的研究。结合乌头汤对RA寒(风湿)证模型的有效性和对热(风湿)证的无效结果，提示中医“疗寒以热”的合理性。
　　本研究的创新点：
　　1.从滑膜血管新生环节切入研究抗RA的中药药效评价方法学，具有较新的研究理念和较高的国际认可度，国内外尚未见相关报道。
　　2.采用体内和体外、局部和系统、形态和功能、药效和机制相结合的研究模式建立相关药效评价方法较符合中药的整体作用特点。
　　3.RA病证结合动物模型是针对具有典型中医证候及明显寒热药性的复方药物药效评价的理想方法，虽受到证候动物模型成熟度的限制，但本研究尝试进行了这方面的探索及验证研究，能为中药药效评价体系的建立及完善提供有意义的参考。
　　4.本研究分别采用传统抗RA中药有效成分、体现中医治则治法的复方以及具有明显药性偏属的经方对所建立评价方法进行多层此、多环节、多角度的验证研究，设计较合理，思路有创新。