原发免疫性血小板减少症气不摄血证病证结合小鼠模型研究

摘要

原发免疫性血小板减少症（Primary immune thrombocytopenia，ITP）是一种以血小板减少、伴或不伴皮肤粘膜瘀紫、鼻衄、内脏出血等为特征的自身免疫性疾病，ITP动物模型是深入研究ITP发病机制与治疗方法的主要手段，在ITP的研究中发挥着重要作用。病证结合动物模型是开展中医药治疗ITP作用机制研究的重要基础，目前ITP的病证结合模型主要有ITP热盛证模型、ITP肾阴虚证模型、ITP气不摄血证模型等，但气不摄血证ITP动物模型的研究还比较少，因此，本文在以往研究的基础上，采用病证结合动物模型拟临床研究的方法，建立ITP气不摄血证病证结合小鼠模型，并对该模型的病理生理机制进行了动态观察，以期为中医气血理论理论研究及中药药效评价提供一种合适的动物模型。
　　目的:
　　1)本课题采用动物模型对照法，比较分析法建立ITP气不摄血证病证结合模型。
　　2)通过对ITP气不摄血证病证结合模型成模过程中生理病理指标的动态监测与比较探索气不摄血证的生理病理分子层面的发病机制。
　　3)通过模型临床指标的监控与临床疾病发生的对比，比较分析出合理的合乎临床的气不摄血证模型。
　　内容与方法:
　　1.小鼠气虚模型的建立与评价
　　将ICR雄性小鼠分为正常对照组、睡眠剥夺组、力竭游泳组、睡眠剥夺+力竭游泳（简称复合组），每组12只，睡眠剥夺组采用每天9小时水环境多平台法进行睡眠剥夺;力竭游泳组采用负重游泳力竭;复合组采用两种方法联合使用，连续4周。观察小鼠行为，测量体重、抓力，数码照相机采集舌面，舌底脉络，足部图像，小动物无创监护仪检测脉搏信号，细胞流式仪检测脾脏B细胞与T细胞亚群。
　　2.小鼠原发免疫性血小板减少症模型的建立
　　将CBA/J雌性小鼠分为正常组与模型组，每组5只。模型组采用腹腔注射哺乳期后雌性Wistar大鼠血小板进行免疫造模，腹腔注射0.5ml含1×108个大鼠血小板的0.9％氯化钠溶液首次免疫，之后每周一次注射0.5×108个血小板强化免疫，正常组腹腔注射生理盐水，连续注射4周。每周免疫注射前，小鼠行尾尖取血测量血小板数。
　　3.小鼠原发免疫性血小板减少症气不摄血证病证结合模型的建立与评价
　　将CBA/J雌性小鼠分为正常组、睡眠剥夺组、免疫组、睡眠剥夺-免疫组，益气摄血方组，每组12只。睡眠剥夺组采用每天16时水环境多平台睡眠剥夺法;免疫组采用腹腔注射哺乳期后Wistar雌性大鼠血小板进行免疫造模;睡眠剥夺-免疫组两种方法联合使用;中药组与睡眠剥夺-免疫组干预一致，并每天灌胃益气摄血方，连续35天。观察小鼠行为，测量体重与抓力，数码照相机采集小鼠舌面图像，小动物无创监护仪检测脉搏信号，称量脾脏指数，胸腺指数;细胞流式仪检测脾脏B细胞与T细胞亚;HE法观察脾脏病理，血细胞计数仪检测血小板数; ELISA检测血清细胞因子。
　　4.小鼠原发免疫性血小板减少症气不摄血证病证结合模型的动态研究
　　将CBA/J雌性小鼠分为正常组、模型组，每组48只。模型组采用多平台水环境法进行睡眠剥夺，每天16小时，并在第二周结合腹腔注射哺乳期后Wistar雌性大鼠血小板进行ITP病症结合造模。正常组与模型组分别在第2、3、4、5周末取材。观察小鼠行为与体重，抓力仪测量小鼠抓力，数码照相机采集舌面，舌底脉络，足部图像，小动物无创监护仪检测脉搏信号，称量脾脏指数，胸腺指数;细胞流式仪检测脾脏B细胞与T细胞亚群;HE法观察脾脏病理，血细胞计数仪检测血小板数;ELISA检测血清细胞因子。
　　结果:
　　1.小鼠气虚模型的建立与评价
　　1)主要症状:与正常对照组比较，三组模型小鼠呈现疲劳特性，体重、抓力显著降低(P＜0.05-0.01)。
　　2)舌像:模型组小鼠舌面呈现不同程度的变白，只有复合组具有显著性差异(P＜0.05)。
　　3)脉象:复合组与睡眠剥夺组小鼠心率、脉搏幅度、呼吸频率、与呼吸幅度均显著降低（P＜0.05-0.01）。
　　4)免疫学:各模型组的CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群显著增加(P＜0.01)，睡眠剥夺组的CD19+B细胞数目显著减少(P＜0.01)。
　　2.小鼠原发免疫性血小板减少症模型的建立
　　1)与正常对照组比较，模型组血小板数目在第2周达到最低点，结果有显著差异(P＜0.01)。
　　3.小鼠原发免疫性血小板减少症气不摄血证病证结合模型的建立与评价
　　1)主要症状:与正常组比较，各模型组小鼠活动能力均降低，体重、抓力显著降低(P＜0.05-0.01)呈现疲劳状态。
　　2)舌像:小鼠舌面均出现不同程度的变嫩白。
　　3)脉象:各组的血氧饱和度均明显下降(P＜0.01-0.05)，睡眠剥夺组，免疫组，睡眠剥夺-免疫组心率值下降，而药物组心率值升高，睡眠剥夺组呼吸频率升高(P＜0.05)，其余组无明显变化(P＞0.05)，睡眠剥夺-免疫组脉搏幅度明显降低(P＜0.05)，其余组无明显差异(P＞0.05)。
　　血液学:模型组巨核细胞成熟障碍，并且出现凋亡小体。
　　4)药物组在前3周血小板数升高明显(P＜0.05)，在4，5周时睡眠剥夺-免疫组血小板数最低(P＜0.01)。
　　5)免疫学:各组脾脏指数均降低（P＜0.05-0.01），睡眠剥夺组，睡眠剥多-免疫组胸腺指数降低，差异明显(P＜0.01-0.05)。
　　各组的CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群明显增加(P＜0.01)，睡眠剥夺组的CD19+B细胞明显减少(P＜0.01)。
　　6)小鼠血小板相关抗体PAIgA与PAIgM无明显差异。
　　7)血清细胞因子各组分泌的IL-6均高于正常组(P＜0.01)，以睡眠剥夺-免疫组差异最大，各组IFN-γ/IL-4比值均变大。
　　4.小鼠原发免疫性血小板减少症气不摄血证病证结合模型的动态研究
　　1)主要症状:与正常对照组比较，各组模型小鼠体重、抓力显著降低(P＜0.05-0.01)，呈现疲劳特性。
　　2)舌像:模型组小鼠舌面均出现不同程度的变嫩白。
　　3)脉象:模型组在第3，4周心率高于正常组(P＜0.01)在第3周之后，脉搏幅度明显低于正常组(P＜0.01)。
　　4)血液学:模型组巨核细胞成熟障碍，且在第5周差异最大。
　　5)在第1-2周，模型组血小板数目高于正常组，差异明显(P＜0.01-0.05)，在第3-5周，模型组血小板数目低于正常组，差异明显(P＜0.01)，在第4周血小板数降低至最低。
　　6)免疫学:模型组脾脏指数与胸腺指数动态观察均低于正常组，其中以在第2，3周时差异显著(P＜0.05)。
　　7)模型组各周次的T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+明显增加(P＜0.01)，在第4，5周CD4+/CD8+明显高于正常组(P＜0.01)，模型组的CD19+B细胞显著减少(P＜0.01)。
　　8)模型组小鼠血小板相关抗体PAIgA，PAIgG比正常组高。随造模时间增长，差异增大，在第5周时PAIgG差异明显(P＜0.05)。
　　9)血清细胞因子模型组分泌的IL-6均高于正常组，差异明显(P＜0.05)，IFN-γ/IL-4比值大于正常组，在第3，4周差异显著(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.睡眠剥夺，力竭游泳，睡眠剥夺+力竭游泳三种方法均可以成功制备气虚小鼠模型，以睡眠剥夺造模最优。
　　2.基于免疫学的抗原交叉模拟原理，通过提取哺乳期后Wistar雌性大鼠血小板，腹腔注射进CBA雌性小鼠体内可模拟临床慢性ITP疾病，以实验2-3周为最佳。
　　3.睡眠剥夺结合血小板免疫5周，可以制备一种ITP气不摄血证病证结合模型，为后续研究ITP机理研究及中药药效评价提供了一种接近临床的动物模型。
　　4.ITP气不摄血证病证结合小鼠模型各项指标，从第2周开始出现病理变化,4周最严重，在第5周时症状及相关指标有所恢复。
　　综上所述，本论文通过造模方法、动物品系、造模时间等因素的选择与优化，初步制备了一种接近临床的ITP气不摄血证的病证结合动物模型。

目录

声明

摘要

英文缩略词

综述

前言

技术路线图

实验一 小鼠气虚模型的建立与评价

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

实验二 小鼠ITP模型的建立

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

实验三 小鼠原发免疫性血小板减少症气不摄血证病证结合模型的建立与评价

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

实验四 小鼠原发免疫性血小板减少症气不摄血证病证结合模型的动态研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

讨论

结论

参考文献

致谢

简历