肠安Ⅱ号方干预IBS-D肥大细胞相关肠上皮通透性改变的机制研究

摘要

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛和排便相关、伴有大便习惯、性状改变等为主要临床表现一组肠功能障碍性综合征。腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)是最常见类型，目前证实IBS患者肠道内普遍存在低度炎症和免疫紊乱，与肠道通透性改变直接相关。近年来MCs参与IBS-D肠上皮屏障功能改变过程的机制成为国内外研究热点。
　　肥大细胞(mast cells，MCs)广泛存在于肠黏膜固有层，参与了渗透性改变这一机制。MCs在神经支配或外界抗原的影响下被激活，脱颗粒释放多种复杂活性物质，其中蛋白酶如类胰蛋白酶(Tryptase)可以通过激活肠上皮细胞膜基底侧的蛋白酶激活受体2(Protease-activated receptor2，PAR-2)引起细胞内信号传导，引起顶膜细胞间构成肠上皮屏障的主要组成部分紧密连接蛋白(tight junction proteins，TJs)的表达改变或重分布。
　　本研究基于先前的研究结果，旨在观察IBS-D患者结肠黏膜肥大细胞与肠上皮细胞屏障功能的相互关系，进一步通过人肥大细胞与人肠上皮细胞的共同培养，直接阐释两细胞间的相互作用，从而间接的反应人体肠道内环境中两者的相互影响。本研究采用中药复方肠安Ⅱ号方及痛泻要方为实验干预药物，探究其在MCs-Caco-2相互作用中的影响。
　　研究目的：
　　本研究旨在以MCs活化致肠上皮细胞屏障损伤为切入点，观察IBS-D患者体内肥大细胞与肠上皮细胞屏障功能的关系，并以此为依据分别建立MCs与肠上皮细胞共培养及外源性Tryptase诱导的肠上皮损伤模型，观察肠安Ⅱ号方在两种屏障损伤模型中的干预作用。
　　研究方法：
　　一、临床部分：纳入IBS-D患者和健康人各6名，取其直乙状结肠粘膜活检组织，对其肥大细胞释放类胰蛋白酶（mast cell tryptase，MCT）和肠上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-1进行免疫荧光双标记，观察肥大细胞与紧密连接关联性。
　　二、实验部分
　　1.采用C48/80诱导HMC-1脱颗粒的方法，并以肠安Ⅱ号方及痛泻要方对其进行干预，ELISA检测细胞上清液中类胰蛋白酶浓度以确定C48/80的最适宜浓度及中药的影响。
　　2.(1)Caco-2在Transwell板分化21天，建立完整的肠上皮屏障;(2)C48/80诱导HMC-1活化后与Caco-2共同孵育24h，建立共培养体系，短路电流测量肠上皮细胞TER、免疫荧光共聚焦观察肠上皮细胞Occludin表达评价其损伤作用;(3)肠安Ⅱ号方及痛泻要方含药血清对共培养造成的屏障损伤进行干预，通过测量肠上皮细胞跨膜电阻(transepithelial electrical resistance，TER)、免疫荧光共聚焦观察肠上皮细胞Occludin表达评价其药物作用。
　　3.采用最佳浓度Tryptase诱导Caco-2细胞造成细胞屏障损伤;肠安Ⅱ号方及痛泻要方含药血清对损伤后细胞进行干预，短路电流测量TER，酶标仪检测荧光大分子FITC-dextran渗透率，Western Blot检测Occludin、Claudin-1、PAR-2蛋白表达，Real Time PCR检测Occludin、JAM-A、PAR-2等mRNA表达，观察肠安Ⅱ号方及痛泻要方含药血清的影响及其机制。
　　研究结果：
　　一、临床部分：IBS-D患者直乙状结肠粘膜MCT表达增多，MCs数量增加，且在上皮附近聚集，Claudin-1蛋白表达减少;正常组相对有较低水平MCT，MCs数量较少，Claudin-1蛋白表达较高。
　　二、实验部分
　　1.ELISA结果提示：(1)C48/80诱导HMC-1脱颗粒随时间延长释放类胰蛋白酶增多（P＜0.05），24h达最高值，但不同浓度间Tryptase水平无显著差异（P＞0.05）;(2)肠安Ⅱ号方及痛泻要方可不同程度抑制HMC-1脱颗粒释放类胰蛋白酶水平（P＜0.05）。
　　2.(1)Caco-2在Transwell板分化21天后TER达到目标值且维持在稳定水平，FITC-dextran渗透系数为10-7，可用于后续实验;(2)C48/80诱导HMC-1脱颗粒并与Caco-2共培养，可使肠上皮细胞TER下降(P＜0.05)，Occludin荧光强度减弱（P＜0.05）;(3)肠安Ⅱ号方及痛泻要方含药血清干预后肠上皮细胞TER值升高(P＜0.05)，但肠安Ⅱ号方低剂量组无明显差异（P＞0.05）;Occludin荧光强度在肠安Ⅱ号方高、中剂量组及痛泻要方组有不同程度的增强(P＜0.05)，且在细胞膜周围表达呈连续性。
　　3.(1)Tryptase浓度的确定：随Tryptase浓度的增大Caco-2细胞TER值逐渐下降，而800ng/ml组在12h时突然升高，24h时接近正常水平;FITC-dextran渗透率随Tryptase浓度增加逐渐增大，800ng/ml时反而出现渗透率降低;透射电镜观察到不同浓度刺激下肠上皮细胞均出现了表面微绒毛断裂畸形，紧密连接结构不完整，缝隙连接增宽，桥粒数量减少;(2)肠安Ⅱ号方及痛泻要方的影响：各中药含药血清干预组TER均高于模型组;肠安Ⅱ号方及痛泻要方组细胞间FITC-dextran渗透率较模型组低(P＜0.05);Western Blot检测Occludin、Claudin-1、PAR-2蛋白在模型组表达降低明显(P＜0.05)，肠安Ⅱ号方及痛泻要方干预均能使表达上调(P＜0.05);Real-Time PCR检测Occludin、JAM-A、PAR-2等mRNA表达在各组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。
　　研究结论：
　　1.IBS-D患者直乙状结肠粘膜上皮层附近MCs数量增加，可能与Claudin-1蛋白表达减少有关。
　　2.肠安Ⅱ号方及痛泻要方含药血清可以抑制HMC-1活化脱颗粒，减少释放类胰蛋白酶水平。
　　3.C48/80诱导活化的HMC-1与Caco-2共培养可以成功构建肠上皮屏障损伤模型。
　　4.肠安Ⅱ号方及痛泻要方含药血清可以改善HMC-1活化致肠上皮屏障损伤，并对外源性Tryptase诱导的屏障损伤同样具有良好的修复作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词

第一部分文献综述

综述一肥大细胞参与肠易激综合征发病机制的研究进展

综述二IBS-D与疏肝健脾中药治疗机理的相关性研究进展

第二部分实验研究

前言

第一章 临床部分 IBS-D肠上皮屏障与肥大细胞的相关性研究

一、临床资料与实验材料

二、实验方法

三、结果

四、讨论

第二章实验部分

研究一HMC-1细胞的活化及肠安II号方疗效观察

研究二肠安Ⅱ号方对HMC-1与Caco-2共培养屏障损伤模型的影响

研究三肠安Ⅱ号方干预Tryptase相关型肠上皮细胞屏障损伤的作用

参考文献

结论

不足与展望

致谢

个人简历