基于网络模块的中医药干预糖尿病微血管并发症异病同治生物学机制初探

摘要

背景:
　　糖尿病微血管病变(Diabetic microangiopathy，DM)包括糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)，糖尿病神经病变(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DKD)，是糖尿病致死致残的主要原因之一。其变部位的广泛性，发病隐匿，常累及全身不同器官，涉及到不同的生理病理系统，临床治疗上亦属于不同的临床分科，有着各自的专科特点。正因如此，许多临床医生忽视了其共存的生理病理基础，缺乏有效的共病治疗策略和治疗的整体观。在现代医学中，此三种疾病生理病理上具有多方面内在联系，在中医学中，“异病同治”从古到今指导中医临床实践，是辨证论治的重要内容。DR，DPN和DKD，在中医上可归属不用的疾病，如雀目、痹症、血痹、水肿等在中医角度上其有同为络脉的损伤，有共同的病因和病机，可采用相同的方法治疗。
　　中医药治疗糖尿病已有千年历史，近年来，随着系统生物学、网络药理学、生物信息学等新兴学科的出现，多学科交叉的研究体系已在中医药防治复杂疾病上逐渐展露头角，运用现在科学技术探讨中医药复方干预复杂疾病的生物学机制成为行之可行的手段。为进一步探讨中医药干预糖尿病微血管并发症异病同治生物学机制，我们以仝小林教授的经验方为例，探讨其多靶点的效应，以探讨中医药干预糖尿病微血管“异病同治”的生物学机制。
　　目的:
　　1.采用网络模块化分析糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变三个并发症，构建疾病的基因网络，识别相应的功能模块，并对生物学功能和信号通路的相关生物学信息，进行富集。以探讨中医“异病同治”理论下干预糖尿病微血管并发症的生物学机制。
　　2.利用网络药理学结合生物信息学，分析仝小林教授经验方（糖痹方）治疗糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿周围神经病变的生物学机机制，进一步揭示中医药治疗糖尿病微血管并发症的生物学机制。
　　方法:
　　1.运用安捷伦文献检索软件糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变相关疾病重叠和独有的相关基因网络，并用软件Cytoscape对数据处理分析。采用DAVID软件6.8版，对模块进行生物学功能富集分析以人类全基因组数据(Human)作为参考背景，选用Functional Annotation Chart功能，以P值小于0.01筛选出GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)两个数据库中具有统计学意义生物过程和信号通路，并且计算重叠基因与独有基因与中药的相关系数。
　　2.筛选出糖痹方中有效成分和相关靶点，运用软件Cytoscape3.2.1构建糖痹方有效成分-靶标相互作用网络以及借助Bisogenet插件，构建糖痹方有效成分-靶标PPI作用网络;通过人类孟德尔遗传数据库OMIM以及GAD数据库，找到糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变，以及糖尿病视网膜病变三个疾病基因数据，以及相关靶点，利用cytosape构建作用网络，以及利用Bisogent构建，疾病之间的PPI网络;将两个PPI网络进行合并，针对核心靶点进行拓扑筛选。对筛选出的靶点进行富集信息，研究糖痹方治疗糖尿病微血管壁并发症的作用机制以及原理。
　　结果:
　　1.分别获得三个疾病重叠基因和各自独有基因的相关网络。DR相关基因的网络包括159个节点489个边，DKD相关的基因网络包含271个节点和985边，和DPN相关基因网络包含381个节点和871边。在MCODE软件中计算后得到模块，其中糖尿病肾病126个模块，糖尿病视网膜病变98个模块，糖尿病周围神经病变72个模块，DKD和DR网络模块中有9个重叠的模块。其中有29个生物功能注释，7个反应过程，6个代谢过程，5个生物合成，4个糖基化，2个氧化过程和自噬、发育过程、途径、转运过程和磷酸化过程，其中确定了4条通路途径，包括糖基化、生物合成、溶酶体和磷酸化途径。DKD与DPN有5个重叠的模块。其中包括了20生物功能注释，8个代谢过程中，5个为生物合成以1各糖基化，1个自噬，1个激素水平调节反应过程，12常见的通路被确定包括8个代谢过程，2个生物合成，对2的合成和代谢过程，1个溶酶体和1个转换通路。DR与DPN有40重叠模块。其中73的生物学功能注释。其中确定了三种途径:如细胞周期、DKDA复制和鞘糖脂生物合。DR、DKD和DPN共享有3个重叠模块，其中包括5的生物合成过程中，4个糖基化，3个代谢过程和1个自噬过程。两个重叠的通路被确定即:溶酶体和鞘糖脂。基于PubMed数据库对三个疾病的重叠基因和独有基因进行检索，重叠基因中仅AKR1B1，EPO找到中药:黄芪、当归、赤芍、红花。其中与糖尿病微血管并发症相关系数较大的有:黄芪、川芎、青蒿、鸡血藤、红景天、雷公藤。其中雷公藤、青蒿在中医辨证处方中很少用到。通过查找文献发现雷公藤、青蒿提取物可影响血管紧张素系统，有着降低血糖、血脂和血压作用，也为临床处方用药提供了新思路。
　　2.通过全查找数据库根据OB≥30％，DL≥0.18进行筛选，找到黄芪成分21种，桂枝6种，白芍14种，鸡血藤25种，川芎8种。找到568个对应的靶点蛋白，将筛选出的成分以及化学成分和靶点蛋白按相互作用对应，导入Cytoscape进行数据分析。显示网络中有1178条边，190个节点。构建成分靶点PPI的网络显示，其中包括2392个节点，56277条边，在OMIM，GAD，TTD数据库中找到糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病的靶点共275种，根据糖痹方化学成分、疾病直接靶点的相互作用关系。根据72个成分和所对应的三个疾病的靶点，构建成分靶点PPI网络，其中包括1768个节点，23494条边。通过DAVID对糖痹方治疗糖尿病微血管并发症的275个节点进行富集分析。最后得到，613个GO生物学过程，其中P值小于0.01的有394个。111个KEGG生物通路，其中P值小于0.01的有86个。
　　结论:
　　1.通过基因网络和模块生物学功能分析，发现糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变，它们共有的病理机制与鞘糖脂和溶酶体生物合成过程相关，提示了三个糖尿病微血管并发症存在类似的生物学机制，侧面论证了中医“异病同治”理论。通过文献分析与并发症基因关系较高的中药，发现了黄芪、青蒿、丹参、蒲黄、川芎、鸡血藤、红景天、雷公藤。其中雷公藤、青蒿3味中药不常用于治疗糖尿病微血管并发症，可能为临床新药研发提供了新的思路。
　　2.对糖痹方治疗糖尿病微血管并发症“异病同治”的网络药理学分析，对糖痹方治疗糖尿病微血管并发症“异病同治”的网络药理学分析，推测糖痹方可通过抑制神经系统中JNK/SAPK信号通路的激活，刺激周围神经再生，通过促进表皮生长因子，抑制炎症反应、减少脂质代谢紊乱，调节VEGF的增长，改善微血管循环，起到多靶点的干预预效应。然而，其应用利用网络药理学分析中药复方的作用机制仍有不少缺点，同时需要更多的临床试验与动物试验去进一步验证。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

第一部分：研究综述

综述一“异病同治’’理论在糖尿病微血管病变中的研究进展

1．DM进行“异病同治”的中医理论基础

2．现代医学基础

3．小结

参考文献

综述二网络模块化分析与网络药理学在中医药研究的进展

1．网络模块化分析在中医药研究的现状

2．网络药理学在中医药研究的现状

3．小结

参考文献

第二部分：正文部分

前言

研究一基于网络模块的糖尿病微血管并发症异病同治生物功能分析

1．研究对象

2．材料和方法

3．研究结果

4．讨论

5．结论

参考文献

研究二基于糖痹方“异病同治”的网络药理学分析

1材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

致谢