基于Hepcidin-OPG/RANKL探讨左归丸治疗去卵巢所致大鼠骨质疏松症的作用机理

摘要

目的
　　以卵巢切除大鼠为骨质疏松症动物模型，从Hepcidin对其下游OPG/RANKL通路调节的角度，部分揭示左归丸治疗骨质疏松症的作用机理。并为进一步阐明“肾主骨”理论的科学内涵提供实验依据。
　　方法
　　将60只SPF级雌性SD大鼠按体重随机分组，分别是空白对照组12只，假手术组12只，造模组36只。造模组大鼠用比例为45mg/kg体重的戊巴比妥钠麻醉后，施以双侧卵巢切除(OVX)手术。假手术组大鼠不切除卵巢，仅切除卵巢周围少许脂肪组织。施术后3个月，再将造模组大鼠按体重随机分为3组:模型组（OVX组）、OVX+戊酸雌二醇组（E2组）、OVX+左归丸组（左归丸组），每组各12只。分组后开始对各给药组大鼠灌胃给药:左归丸组大鼠灌胃给予左归丸水煎液，给药浓度为0.968 g生药/ml，给药体积为1 ml/100g体重，给药剂量为9.68 g生药/kg体重;E2组大鼠灌胃给予戊酸雌二醇混悬液，给药浓度为0.018mg/ml，给药体积为1 ml/100g体重，给药剂量为0.18 mg/kg体重。以上给药，一天一次，连续6天，休息1天后，再连续给药6天，如此给药3个月。空白对照组、假手术组和模型组大鼠按上法灌胃给予等体积的纯净水。灌胃期间，根据每周所称取的体重调整给药量。
　　各组大鼠于处死前16天和前3天分别腹腔注射盐酸四环素0.5ml/100g体重，对骨组织进行荧光标记。给药结束后，将大鼠迅速处死，取肝脏，制作石蜡切片，用于肝脏铁离子水平的检测以及Hepcidin蛋白和mRNA表达的检测;取左侧股骨，用于骨生物力学指标的检测;取左侧胫骨，制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学指标的检测;取右侧胫骨，用EDTA脱钙，制作冰冻切片，用于骨组织中膜转铁蛋白1(Fpn1)以及OPG、RANKL蛋白和mRNA表达的检测。
　　实验结果皆以均数±标准差（x±s）表示，均采用SPSS20.0统计软件进行统计学处理。先进行正态性检验，正态分布数据两组以上的比较，采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较，方差齐性的采用其项下的LSD检验;方差不齐的则采用其项下的Dunnett's T3(3)检验;若数据为非正态分布时，采用非参数检验。
　　结果
　　1左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响
　　OVX组大鼠胫骨TBV％显著低于假手术组。E2组、左归丸组的大鼠胫骨TBV％较OVX组显著增高，但仍显著低于假手术组。
　　与假手术组相比，OVX组大鼠胫骨TRS％和TFS％均显著增高。E2组和左归丸组的大鼠胫骨TRS％和TFS％均显著低于OVX组，且E2组大鼠胫骨TFS％与假手术组无差异;但左归丸组大鼠的胫骨TRS％和TFS％以及E2组大鼠的TRS％仍明显高于假手术组。
　　OVX组大鼠的胫骨OSW、MAR、mAR均显著高于假手术组。与OVX组相比，E2组和左归丸组的大鼠胫骨OSW、MAR、mAR均显著降低;E2组的上述指标与假手术组无差异，但左归丸组的OSW、MAR、mAR仍显著高于假手术组。
　　2左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠股骨最大载荷(N)、弯曲强度(MPa)、弹性模量(GPa)的影响
　　OVX组大鼠股骨的最大载荷、弯曲强度、弹性模量水平均显著低于假手术组;与OVX组相比，E2组、左归丸组的最大载荷、弯曲强度、弹性模量水平都显著升高，且E2组大鼠股骨的弯曲强度和弹性模量以及左归丸组大鼠股骨的弹性模量均与假手术组无差异;但左归丸组大鼠股骨的最大载荷和弯曲强度以及E2组大鼠股骨的最大载荷仍明显低于假手术组。
　　3左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠肝组织中铁离子水平的影响
　　与假手术组相比，OVX组的普鲁士蓝着色面积百分比显著增高;与OVX组相比，E2组、左归丸组的普鲁士蓝着色面积百分比明显下降，但仍高于假手术组。这一结果说明，OVX组大鼠肝组织中铁离子含量显著高于假手术组，而E2组、左归丸组大鼠肝组织中铁离子含量较OVX组下降明显，但仍高于假手术组。
　　4左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠肝组织中Hepcidin蛋白及mRNA表达的影响
　　与假手术组相比较，OVX组大鼠肝组织中Hepcidin蛋白及mRNA表达IOD显著降低;与OVX组相比，E2组和左归丸组的肝组织中Hepcidin蛋白及mRNA表达IOD则明显升高，但仍显著低于假手术组。
　　5左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中Fpn1、OPG、RANKL蛋白及mRNA表达的影响
　　与假手术组相比，OVX组大鼠的胫骨骨髓中的Fpn1 mRNA表达IOD显著增高;与OVX组相比，E2、左归丸组的Fpn1 mRNA表达IOD显著降低，但仍明显高于假手术组。
　　与假手术组相比，OVX组大鼠的胫骨骨髓中OPG蛋白及mRNA表达IOD显著降低;与OVX组相比，E2组、左归丸组的OPG蛋白及mRNA表达阳性密度明显增高，且E2组OPG mRNA表达IOD与假手术组无差异;左归丸组OPG蛋白及mRNA以及E2组OPG蛋白表达IOD仍明显低于假手术组。
　　与假手术组相比，OVX组大鼠胫骨骨髓中RANKL蛋白和mRNA表达IOD显著增高;与OVX组相比较，E2组、左归丸组RANKL蛋白和mRNA表达的IOD均显著下降，但仍高于假手术组。
　　上述指标假手术组与空白对照组均无差异，从而排除了手术因素对实验结果的影响。
　　结论
　　(1)切除大鼠卵巢可导致高转换型骨质疏松症，即骨吸收和骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，而使骨量丢失。而左归丸可降低过高的骨转换率，提高骨量，对卵巢切除所致的骨质疏松症产生治疗作用。
　　(2)切除大鼠卵巢可使肝组织分泌Hepcidin减少，铁离子沉积，发生铁过载;同时骨髓细胞上的RANKL表达显著上调，而OPG及Fpn1表达显著下调;两者共同作用，导致破骨细胞异常活跃，骨量丢失。而左归丸可通过提高Hepcidin水平，改善卵巢切除所致的铁过载，进而对下游的OPG/RANKL信号通路起到调节作用，最终使破骨细胞活性降低，减少骨量丢失。这是其能够治疗骨质疏松症的机理之一。
　　以上结果同时表明:铁调素对铁过载的调节作用在“肾主骨”中起着一定作用。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

综述 中药补肾复方治疗骨质疏松症的研究进展

前言

材料与方法

1 材料

1．1 实验动物

1．2 药物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 动物分组及处理

2．2 取材

2．3 不脱钙骨切片的制作

2．4 脱钙骨冰冻切片的制作

2．5 肝脏石蜡切片的制作

2．6 指标检测

2．7 统计学分析

结果

1 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响

2 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠股骨最大载荷(N)、弯曲强度(MPa)、弹性模量(GPa)的影响

3 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠肝组织中铁离子水平的影响

4 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠肝组织中Hepcidin蛋白及mRNA表达的影响

5 左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠胫骨骨髓中Fpn1、OPG、RANKL蛋白及mRNA表达的影响

讨论

1 中医“肾主骨”理论与骨质疏松症关系探讨

2 左归丸对骨质疏松症的治疗作用探讨

3 基于Hepcidin-OPG／RANKL探讨左归丸治疗骨质疏松症的作用机理

结论

参考文献

致谢

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