慢性间歇性低氧复合胰岛素抵抗介导的动脉粥样硬化过程中SREBP-1c/FAS信号通路的作用及益气活血中药的干预效应研究

摘要

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopneasyndrome，OSAHS)发病率高，可导致高血压、心肌梗死、心力衰竭甚至夜间猝死等的发生，是心血管疾病的独立危险因素，其继发心血管疾病又以动脉粥样硬化性心血管疾病为常见。慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是OSAHS的核心病理基础，在OSAHS患者常与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)及糖脂代谢紊乱并见。CIH与IR协同能促进血管内皮损伤及OSAHS继发动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生，进而推动OSAHS相关心脑血管疾病的发生发展。目前研究提示SREBP-1c/FAS信号通路可能在CIH及IR介导的AS过程中扮演了重要角色。现代中医理论认为AS与气虚血瘀的病机密切相关，前期已有研究显示益气活血中药具有抗炎、改善IR、改善氧化应激、保护血管内皮等效应而适用于OSAHS继发AS的治疗，但其作用机制尚未明确。本研究即是以CIH复合IR介导的AS为切入点，在中医基础理论指导下选择益气活血法常用中药配伍人参、川芎的代表成分人参皂苷和川芎嗪作为干预药物进行的基础实验研究。本研究通过构建CIH复合IR模型体系，分别于体外细胞实验及整体动物实验观察S REBP-1c/FAS信号通路在CIH复合IR介导的AS过程中的作用;并观察益气活血中药的干预效应及探讨潜在机制，以期为中西医结合防治OSAHS相关心血管疾病的临床应用提供基础研究证据。
　　本论文分为两个主要部分:
　　一、文献综述:分别从阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征相关心血管疾病的中西医结合研究进展、慢性间歇性低氧在动脉粥样硬化形成中的作用及机制两个方面进行传统文献综述;并对中药人参制剂对IR干预效应进行系统评价，发现与其他非中药干预措施、西药标准治疗或常规治疗相比，联合使用中药人参制剂能够对2型糖尿病、代谢综合征患者的IR产生一定的干预效应，具有改善IR和血糖水平的作用，且不良反应少，安全性尚可。
　　二、实验研究:分为四部分实验:①间歇性低氧复合胰岛素抵抗细胞模型的建立及间歇性低氧对SREBP-1c/FAS信号通路的影响研究;②益气活血中药单体对间歇性低氧复合胰岛素抵抗细胞模型的干预效应及机制研究;③慢性间歇性低氧复合胰岛素抵抗动物模型的建立及慢性间歇性低氧对SREBP-1c/FAS信号通路的影响研究;④益气活血中药对慢性间歇性低氧复合胰岛素抵抗动物模型的干预效应研究。
　　研究一间歇性低氧复合胰岛素抵抗细胞模型的建立及间歇性低氧对SREBP-1c/FAS信号通路的影响研究
　　目的:体外建立间歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）复合IR的3T3-L1脂肪细胞模型，观察IH复合IR对SREBP-1 c/FAS信号通路的影响。
　　方法:3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞诱导分化为成熟3T3-L1脂肪细胞;用含DEX1×10-6mol/L的完全培养基诱导3T3-L1脂肪细胞，建立IR-3T3-L1脂肪细胞模型;IH环境处理IR-3T3-L1脂肪细胞模型，IH循环次数分别为0次、2次、4次、8次、16次、32次，并设立持续性低氧(SH)组，采用qPCR法检测SREBP-1c、FAS及IRS-1的mRNA表达水平，采用Western-blotting法检测SREBP-1及FAS的蛋白表达水平。
　　结果:1.3T3-L1细胞在加分化液II诱导分化后d8-d11细胞分化率均可达到80％以上，成功分化为成熟的3T3-L1脂肪细胞;
　　2.DEX处理分化成熟的3T3-L1脂肪细胞96h后培养基葡萄糖消耗减少、IRS-1mRNA表达水平减低，P＜0.05;
　　3.IH处理IR-3T3-L1脂肪细胞，在32个循环以内，SREBP-1c、FAS mRNA及蛋白的表达水平随IH循环次数的增加而增高;IH处理32个循环时，IRS-1mRNA的表达水平降低，P＜0.05，且低于SH组，P＜0.05。
　　结论:在一定范围内，IH可促进IR-3T3-L1细胞SREBP-1 c/FAS通路的表达，且表达水平与IH循环次数存在正相关性;且在细胞水平，IH有加重IR程度的效应。
　　研究二益气活血中药单体对间歇性低氧复合胰岛素抵抗细胞模型的干预效应及机制研究
　　目的:观察益气活血中药单体人参皂苷Re(ginsenoside Re)联合川芎嗪（tetramethylpyrazine or ligustrazine，TMP）对IH复合IR的3T3-L1脂肪细胞模型的干预效应，并观察SREBP-1c/FAS信号通路在其中的作用。
　　方法:建立IH+IR-3T3-L1脂肪细胞模型;分别筛选人参皂苷Re、TMP的适宜干预浓度，以含人参皂苷Re0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、500μmol/L的培养基及含TMP0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L、10000μmol/L的培养基处理IR-3T3-L1脂肪细胞，采用CCK-8法检测细胞活性，qPCR法检测SREBP-1c及FAS的mRNA表达水平;选取抑制SREBP-1c及FAS作用的有效浓度，形成4种益气活血中药单体浓度组合:①Re1μmol/L+TMP1μmol/L、②Re1μmol/L+TMP10μmol/L、③Re10μmol/L+ TMP1μmol/L、④Re10μmol/L+ TMP10μmol/L,qPCR法检测SREBP-1c及FAS的mRNA表达水平，选择Re+TMP的最适作用浓度。将IR-3T3-L1脂肪细胞分为常氧对照组(Con)组、模型组(IH)、SREBPs抑制剂组(Betulin)及益气活血中药组(Re+TMP)，分别以相应药物加入到培养基预处理24h，后三者进行IH循环32次，Western-blotting法检测各组SREBP-1及FAS的蛋白表达水平，qPCR法检测IRS-1、IL-6、SOD、HIF-1α的mRNA表达水平。
　　结果:1.不同浓度的人参皂苷Re对细胞活性的影响差异无统计学意义，P＞0.05，Re浓度为1μmol/L、10μmol/L时降低了IH引起的SREBP-1c mRNA表达上调，P＜0.05;不同的TMP浓度对细胞活性影响不同，其中浓度10000μmol/L降低细胞活性，P＜0.05，TMP浓度为1μmol/L、10μmol/L时降低了IH引起的SREBP-1c mRNA表达上调，P＜0.05;
　　2.Re+TMP浓度为Re1μmol/L+ TMP10μmol/L时，对IH条件下SREBP-1c、FASmRNA表达水平抑制最明显，P＜0.05;
　　3.Betulin、Re+TMP能抑制IH引起的SREBP-1、FAS蛋白表达水平上调，P＜0.05，升高IH条件下IRS-1、SOD mRNA表达水平，P＜0.05，降低IH条件下HIF-1αmRNA表达水平，P＜0.05。
　　结论:人参皂苷Re与TMP体外联合作用能抑制IH对IR-3T3-L1细胞SREBP-1c/FAS通路表达水平的上调作用，且有一定的改善IR、氧化应激的效应。
　　研究三慢性间歇性低氧复合胰岛素抵抗动物模型的建立及慢性间歇性低氧对 SREBP-1c/FAS信号通路的影响研究
　　目的:建立CIH复合IR的ApoE-/-小鼠AS模型，观察CIH复合IR对SREBP-1c/FAS信号通路的影响。
　　方法:ApoE-/-小鼠给予高腊饮食连续喂养满4w后，腹腔注射STZ溶液建立IR-ApoE-/-小鼠模型;16只IR-ApoE-/-模型小鼠随机分为分为常氧对照组(NA)和模型组(CIH)，每组8只，予高脂饮食喂养， C57BL/6J小鼠8只作为空白对照组(Con)，予常规饲料饲养;低氧动物饲养仪予CIH组IR-ApoE-/-模型小鼠IH处理，使氧浓度在每一循环前90s内下降至10±0.5％，循环后90s内上升为21±0.5％，每日09:00-17:00处理8h，连续处理8w;小鼠每4w称体重1次，检测血糖1次;实验结束时心脏取血，ELISA法检测各组小鼠血清胰岛素水平;油红O染色观察主动脉AS斑块情况;取余主动脉、骨骼肌、肝组织，分别采用qPCR法、Western-blotting法检测主动脉、骨骼肌、肝SREBP-1c及FAS的mRNA及蛋白表达水平，主动脉、骨骼肌、肝IRS-1的mRNA表达水平及蛋白磷酸化水平。
　　结果:1.CIH处理4w及8w，NA组、CIH组血糖水平均高于Con组，P＜0.05;CIH处理8w，NA组及CIH组胰岛素水平较Con组增高，且CIH组较NA组增高，P＜0.05;
　　2.主动脉、骨骼肌及肌组织IRS-1的mRNA表达水平及蛋白磷酸化水平比较，NA组、CIH组均比Con组降低，P＜0.05;
　　3.各组主动脉近心端AS斑块油红O染色情况，CIH组小鼠主动脉可见明显的AS斑块;
　　4.组织SREBP-1c、FAS mRNA表达水平的比较，CIH组主动脉、骨骼肌、肝组织均较Con组升高，P＜0.05;组织SREBP-1c、FAS蛋白表达水平的比较，主动脉、骨骼肌SREBP-1c、FAS较Con组升高，P＜0.05。
　　结论:CIH能够促进ApoE-/-小鼠IR的发展，且CIH复合IR能够上调ApoE-/-小鼠主动脉、骨骼肌及肝组织SREBP-1c/FAS信号通路的表达水平，最终导致AS的进展。
　　研究四益气活血中药对慢性间歇性低氧复合胰岛素抵抗动物模型的干预效应研究
　　目的:观察益气活血中药配伍人参、川芎的主要成分人参皂苷联合川芎嗪(TMP)对CIH复合IR-ApoE-/-小鼠模型AS的干预效应，并观察SREBP-1c/FAS信号通路在其中的作用。
　　方法:建立CIH+IR-ApoE-/-小鼠模型;70只IR-ApoE-/-模型小鼠随机分为常氧对照组(NA)、模型组(CIH)、SREBPs抑制剂组(Betulin)、阿托伐他汀组(WM)、益气活血中药低剂量组(TCM-L)、益气活血中药中剂量组(TCM-M)、益气活血中药高剂量组(TCM-H)7组，每组10只，分别在每日IH处理前予生理盐水、Betulin、阿托伐他汀、益气活血中药（人参皂苷+TMP）低、中、高剂量灌胃，常规饲养的C57BL/6J小鼠10只作为空白对照组(Con)，连续给药8w。小鼠每4w称体重1次，检测血糖1次;实验结束时心脏取血，ELISA法检测血清胰岛素、C反应蛋白(CRP)水平，比色法检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平;油红O染色比较各组小鼠主动脉AS斑块情况;取余主动脉、骨骼肌、肝组织，分别采用qPCR法、Western-blotting法检测主动脉、骨骼肌、肝SREBP-1c及FAS的mRNA及蛋白表达水平，主动脉炎症细胞因子TNF-α、IL-6、CD106（VCAM-1）mRNA及蛋白表达水平，主动脉、骨骼肌、肝IRS-1的mRNA表达水平及蛋白磷酸化水平，主动脉、肝HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平。
　　结果:1.实验期间CIH组死亡2只，Betulin组死亡1只，TCM-L组死亡1只，TCM-M组死亡1只，共计死亡5只;实验结束时，WM组与TCM-H组小鼠体重较轻，与NA组、CIH组、Con组比较P＜0.05; TCM-H组血糖减低，与其他实验组比较P＜0.05，各组小鼠胰岛素水平差异无统计学意义P＞0.05;血脂水平比较，CIH组TC、TG、LDL-C水平高于Con组，P＜0.05，HDL-C水平低于Con组，P＜0.05，Betulin组、WM组、TCM-H组HDL-C水平高于CIH组，P＜0.05，TCM-M组、TCM-H组LDL-C水平低于CIH组，P＜0.05; CIH组血清CRP水平高于其他各组，P＜0.05; CIH组血清SOD水平低于Con组、NA组，P＜0.05，TCM-H组较CIH组升高，P＜0.05;
　　2.各组主动脉近心端AS斑块油红O染色情况，NA组、CIH组小鼠主动脉可见明显的AS斑块，Betulin组、WM组、TCM-H组油红O染色所示AS斑块减小;胸主动脉及腹主动脉进行大体油红O染色，CIH组AS斑块散在多发，且面积较大，WM组及TCM-H组AS斑块较CIH减少且面积较小;
　　3.组织SREBP-1c/FAS信号通路的表达水平的比较，CIH组主动脉、骨骼肌、肝组织SREBP-1c、FAS mRNA及蛋白表达水平均较Con组升高，P＜0.05;TCM-H组主动脉、骨骼肌SREBP-1c、FAS mRNA及蛋白表达水平均较CIH组降低，P＜0.05;
　　4.主动脉炎症细胞因子表达水平的比较，CIH组TNF-α、IL-6、CD106（VCAM-1）mRNA及蛋白表达水平均比Con组升高，P＜0.05; TCM-H组TNF-α、IL-6、CD106(VCAM-1) mRNA表达水平均较CIH组降低，P＜0.05; TCM-H组TNF-α、CD106(VCAM-1)蛋白表达水平较CIH组降低，P＜0.05;
　　5.组织IRS-1 mRNA表达水平的比较，CIH组主动脉、骨骼肌、肝组织均较Con组降低，P＜0.05; p-IRS-1的蛋白表达水平比较，TCM-H组主动脉、骨骼肌、肝组织均较CIH组升高，P＜0.05;
　　6.组织HIF-1α表达水平的比较，CIH组主动脉、肝HIF-1αmRNA及蛋白表达水平均较Con组升高，P＜0.05; TCM-H组主动脉、肝HIF-1αmRNA及蛋白表达水平均较CIH组降低，P＜0.05。
　　结论:益气活血中药配伍（人参皂苷、TMP）能够一定程度改善CIH复合IR的ApoE-/-小鼠IR及血脂水平，降低炎症反应和氧化应激程度，并最终抑制AS进展，其机制可能与抑制SREBP-1 c/FAS信号通路的表达水平有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

文献综述

综述一 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征相关心血管疾病的中西医结合研究进展

参考文献

综述二 慢性间歇性低氧在动脉粥样硬化形成中的作用及机制

参考文献

前言

实验研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

研究二 益气活血中药单体对间歇性低氧复合胰岛素抵抗细胞模型的干预效应及机制研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

研究三 慢性间歇性低氧复合胰岛素抵抗动物模型的建立及慢性间歇性低氧对SREBP-1c／FAS信号通路的影响研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

研究四 益气活血中药对慢性间歇性低氧复合胰岛素抵抗动物模型的干预效应研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

创新点

论文小结

论文说明

致谢

个人简介