伤害性神经肽与肥大细胞在针刺穴位中的应答

摘要

穴位是针刺疗法的作用点也是起效的的关键点，从《内经》定穴开始，医家不断研究穴位。从以前的穴位功能到六十年代的解剖结构及组织结构，到现代的穴位动态的网络作用。从神经、血管、组织液、肌肉、结缔组织到细胞、因子，分子、神经肽，到底穴位下什么物质起到治病效果呢？这是研究者们一直关注的点，第一:穴位之间是否有共性，其共性来源于何处。第二:针刺刺激穴位后，在穴区所引起了什么样的反应，使之针刺有疗效，这是我们要解决的问题。
　　穴位的组织结构与细胞化学成份一直是针灸界所重视的，以往研究表明穴位解剖结构并没有特异性，故近年来研究者们把目光移向细胞化学成份和动态结构。肥大细胞(mast cell，MC)作为一种普遍的免疫细胞，近年来备受关注。研究表明MC与经络现象密切相关，故可推断MC在穴位中的作用也是不可忽视的，所以本研究以针刺穴位前后围绕着MC来展开。MC作为一种免疫细胞在针灸过程中通过脱颗粒释放出生物活性物质参与机体的防御并发挥治疗作用，但是与其相关的作用机制还不是很清楚，尤其是对相关生物活性物质研究的更少。为了更好地研究针刺穴位后局部组织相关细胞化学成分变化，我们主要以大鼠”百会”、”三阴交”、“合谷”穴区作为切入点，使用荧光组化与荧光免疫组化手段结合三维重建技术及激光共聚焦显微成像，分别对非针刺和针刺后”百会”、”三阴交”、“合谷”穴区局部组织化学特征进行观察对比，从形态学和生物化学两方面解析穴位局部的组织细胞化学结构随针刺的改变，并在此基础上采用三维观察分析技术对穴位组织细胞化学结构进行立体重建。通过本研究我们不仅探讨了针刺后穴位局部的组织细胞化学特征的变化，而且将为研究穴位结构和功能提供新的技术手段，为穴位功能的动态研究奠定基础。
　　目的:
　　1.运用荧光免疫组织化学技术、共聚焦技术、三维重建和系统分析的方法揭示不同穴位的组织细胞化学成份的比较。从小鼠“百会”“胃俞”“中脘”“合谷”等穴区入手观察不同指标: MC、组织胺(Histamine，HA)、五羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)降钙素基因相关肽(Calcitonin gene relatedpeptide，CGRP)、香草醛亚型-1(transient receptor potential vanilloid type-1，TRPV1，VR1)和P物质(Substance P，SP)。
　　2.运用荧光免疫组织化学技术、共聚焦技术、三维重建和系统分析的方法揭示针刺对穴区皮肤局部组织细胞化学成分的影响。主要从“合谷”“百会”“三阴交”穴区入手观察针刺引起的不同组织细胞化学成份的变化及相互关系。
　　方法:
　　以正常小鼠及大鼠为实验对象，先剔除穴区毛，针刺一侧穴位三分钟捻转出针，另一侧作为对照。做完手法之后，将小鼠和大鼠用心脏灌流法使其组织固定，等充分固定后取材，取材部位为针刺部位的穴区皮肤组织及对侧的与其对应的正常组织。取材完成后将组织放在含的4％多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)中2h到4h，进行后固定，之后清洗并移至含有25％蔗糖的的0.1 mol/L PB(pH7.4)用于脱水至组织完全下沉。将脱水后的组织以恒冷箱切片机制成20μm的切片，随后进行染色，染色方法如下:将组织切片分成5组:第一组用MC荧光免疫组织化学方法和鬼笔环肽(Phalloidin)荧光组织化学方法染色，用于判断MC和血管之间的关系以及针刺后MC的形态改变;第二组用MC结合5-HT免疫荧光组织化学方法观察其共表达;第三组用MC结合HA免疫荧光组织化学方法观察其共表达;第四组观察MC和神经纤维末梢SP表达;第五组观察MC和神经纤维末梢CGRP的表达。
　　具体操作如下:1）先用组织化学笔把切片画好圈使组织均包含其内，注意避免接触组织，然后用含3％山血清、0.1 mol/L PB(pH7.4)和0.5％ TritonⅩ-100的封闭液孵育0.5h;2）在第一组切片上加小鼠anti MC Tryptase抗体(1∶1000)，在第二组同时加小鼠anti MC Tryptase抗体(1∶1000)和兔anti5-HT Serotonin抗体(1∶1000)，在第三组切片上同时加小鼠anti MC Tryptase抗体(1∶1000)和兔anti HASerotonin抗体(1∶1000)，在第四组切片上同时加小鼠anti MC Tryptase抗体(1∶1000)和兔anti SP神经纤维抗体(1∶1000)，在第五组切片上同时加小鼠anti MC Tryptase抗体(1∶1000)和兔anti CGRP神经纤维抗体(1∶1000)并放置于湿性盒中过夜，抗体的稀释液中含1％山羊血清、0.5％ TritonⅩ-100和0.1 mol/L PB(pH7.4);3)次日用0.1mol/L PB洗净后，在第一组切片上同时加Alexa594荧光素化的山羊anti小鼠二次抗体(1∶500)和Alexa488荧光素化Phalloidin(1∶1000)，在第二组切片上同时加Alexa488荧光素化的山羊anti小鼠二次抗体(1∶500)和Alexa594荧光素化的山羊anti兔二次抗体(1∶500)，在第三组切片上同时加Alexa488荧光素化的山羊anti小鼠二次抗体(1∶500)和Alexa594荧光素化的山羊anti兔二次抗体(1∶500)，在第四组切片上同时加Alexa488荧光素化的山羊anti小鼠二次抗体(1∶500)和Alexa594荧光素化的山羊anti兔二次抗体(1∶500)，在第五组切片上同时加Alexa488荧光素化的山羊anti小鼠二次抗体(1∶500)和Alexa594荧光素化的山羊anti兔二次抗体(1∶500)，在室温下放置2h后，稀释液成分与上面用的相同;4）经上面操作后的两组组织切片用0.1 mol/L PB清洗3次后，再用核酸特异性荧光染料DAPI(1∶500000)复染，约6 min，再次清洗，然后以稀释度(1∶1)的甘油溶液加盖封片。从二抗开始实验要求避光处理。
　　处理完成的组织切片用激光共聚焦成像系统记录结果并拍摄留存。记录图像时设置和检测指标免疫组化二抗时符合的光谱频段，同时设置不同通道的亮度对比度等参数趋于统一。10X镜下记录的照片拍摄方式为单层扫描，分辨率(AspectRatio)设为1024by，井深(CA)设为152μm;40X及以上倍数的照片记录模式为多层扫描三维复合成像，(Aspect Ratio)设为640by，井深(CA)设为80μm，步进(StepSize)设为1.5μm，每张图片依据指标表达情况复合10-15张重建复合形态。部分实验图片采用Imaris7.6.2软件进一步三维重建、渲染编辑以及图像分析。
　　结果:
　　1.不同穴位的组织细胞化学成分比较:经过正常小鼠“百会”“胃俞”“中脘”以及“合谷”等穴区局部皮肤组织中相关化学成分的对比分析，本研究发现Phalloidin标记的血管样结构、5-HT以及HA在各穴区均有表达，然而在各个穴区存在着量的差异。采用免疫双标记法标记观察了小鼠百会穴区5-HT和MC或者5-HT和HA的共表达，在正常百会穴区存在5-HT、HA和形态完整的MC，主要分布在真皮下，MC和HA均与5-HT共表达。同样使用荧光免疫组织化学染色技术记录了CGRP和SP或者CGRP和VR1的双标情况，于对照组的合谷穴皮下我们也观察到了SP、VR1和CGRP阳性标记的神经纤维位于皮下。另外可观察到一些神经纤维向表皮延伸的现象。
　　2.针刺引起穴区组织细胞化学成分的改变:采用免疫标记法标记观察了”百会”、”三阴交”、“合谷”穴区5-HT、HA以及类胰蛋白酶(Tryptase)阳性表达的MC，在正常”百会”、”三阴交”、“合谷”穴位局部皮肤组织中同样存在HA、5-HT以及静息状态下的MC，经过针刺干预，MC呈汇聚状态分布并伴随脱颗粒现象发生，脱出的样物质聚集在其周围而且数量明显增多，5-HT及HA数目增多聚集。在正常的合谷穴区有少量的SP和CGRP标记的阳性神经纤维，针刺后这两种神经肽在神经纤维的表达增加;正常”百会”、”三阴交”、“合谷”穴区真皮下层和皮下组织中的血管周围存在一定数量的MC，部分呈HA、5-HT阳性表达;针刺后，MC向针刺部位聚集伴有脱颗粒，胞体及其脱颗粒同时呈HA、5-HT阳性表达。
　　结论:
　　1.小鼠“百会”“胃俞”“中脘”“合谷”穴位的组织细胞化学成分比较:各个穴位局部的组织构架相同，其中分布的细胞以及神经化学成分也无差异，这些或许为不同穴位产生共性效用的基础，同样也是穴位产生部位普遍性的基础。
　　2.针刺引起大鼠“百会”“三阴交”“合谷”穴区组织细胞化学成份的改变:穴区未发现有特异性的组织构架差异，然而针刺能够对其局部皮肤组织中相关细胞化学成分起到调节作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

第一部分 穴位局部作用机理现状

1．针刺作用的基础——穴位

2．穴位形态学研究

3．穴位免疫学研究

4．穴区皮肤组织内相关细胞化学成份是针刺起效的关键环节及重要切入点

参考文献

第二部分 实验研究

1．材料与方法

1．1 实验动物及分组

1．2 主要化学试剂和仪器

1．3 针刺方法

1．4 灌流取材与保存方法

1．5 切片制备与检测方法

1．6 图像编辑与数据分析

2．实验结果

2．1 小鼠“百会’’穴位的部分组织细胞化学成分分布观察

2．2 小鼠“百会’’‘胃俞”中脘”“合谷”穴位的组织细胞化学成分比较

2．3 针刺引起大鼠“百会”及“三阴交”穴区组织细胞化学成份相关变化

2．4 针刺引起大鼠“合谷”穴区组织细胞化学成份相关变化

3．讨论

3．1 不同穴位的组织细胞化学成分比较

3．2 针刺引起穴区皮肤细胞化学成份变化

3．3 皮下组织中伤害性神经肽与细胞组织化学物质

第三部分 结论

参考文献

致谢

个人简历