复方小花清风藤浸膏抗急性肝损伤作用及对炎症干预作用的机制研究

摘要

很多因素都可以引起肝脏损伤，包括外伤导致的肝损伤、化学性肝损伤(包括药物性肝损伤和非药物性肝损伤，主要是由于平时用药及酒精等因素造成的肝脏损伤)以及病毒性肝炎所导致的肝损伤等。其中以病毒性肝炎引起的肝损伤最为常见。我国是HBV感染的高发区，根据1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查，人群HBsAg携带率达9.75％，约1.2亿人。探讨中药对肝脏的保护作用以及抗炎的机制对开发新的抗肝炎药物有重要意义。近年的研究表明：肝炎的发生机制除与引起炎症的病毒有关外，还与机体的免疫机制引起的肝脏损伤有关。炎症的组织学特征是炎性细胞浸润，细胞因子、炎症介质和转录因子等都在肝炎发病的病理过程中起关键性作用。 小花清风藤(Sabia.parvifloraWall.exRoxb)为苗族民间药物，是清风藤科清风藤属藤本植物，主要分布于云南、广西、贵州等地，以前的研究资料表明，其对甲肝及乙肝的治疗效果均较显著，有很好的利湿退黄和降转氨酶作用。但相关的药理研究资料极少。贵州省科技产业厅立项，对该药进行化学和活性的系统研究，并研制抗肝损伤的新药。复方小花清风藤浸膏主要由小花清风藤、三七、石斛组成，有清肝利胆的功效，主要用于治疗病毒性肝炎。 本研究采用四氯化碳、α-萘异硫氰酸酯、D-氨基半乳糖、卡介苗联合脂多糖诱发四种肝损伤模型，采用生物化学、酶联免疫分析、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应等手段，从肝脏功能、脂质过氧化、细胞因子的表达、肝细胞凋亡以及转录因子的活化等环节探讨了复方小花清风藤浸膏对不同肝损伤模型的保护作用及其对炎症干预作用的相关机制。 第一部分复方小花清风藤对急性肝损伤动物模型的保护作用1复方小花清风藤对四氯化碳(CCL4)、α-萘异硫氰酸酯(ANIT)致小鼠肝损伤模型的保护作用目的：研究复方小花清风藤对四氯化碳致急性化学性肝损伤模型及α-萘异硫氰酸酯致胆瘀症模型小鼠血清中转氨酶、碱性磷酸酶及胆红素含量的影响，探讨复方小花清风藤对肝细胞膜通透性和胆汁排泄功能的影响。 方法：分别采用四氯化碳皮下注射、α-萘异硫氰酸酯灌胃致小鼠急性肝脏损伤，观察复方小花清风藤对四氯化碳致肝损伤模型小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)含量的影响；α-萘异硫氰酸酯致肝损伤模型小鼠血清中ALT、AST、碱性磷酸酶(ALP)及总胆红素(T-Bil)含量的影响。 结论：复方小花清风藤对四氯化碳、α-萘异硫氰酸酯所造成的肝脏损伤有一定的保护作用。 2复方小花清风藤对D-氨基半乳糖致大鼠肝损伤模型的保护作用目的：探讨复方小花清风藤对D-氨基半乳糖致肝损伤模型大鼠肝细胞膜通透性、肝脏的合成功能、肝脏病理形态学改变及脂质过氧化损伤的影响。 方法：采用D-氨基半乳糖腹腔注射致大鼠肝脏损伤，观察复方小花清风藤对模型大鼠血清中ALT、AST、SOD、GSH、TP、ALP、ALB、Glu、T-Bil含量的影响，以及肝脏中SOD和MDA含量的影响。并做HE染色、PAS染色及甲绿-派罗宁染色观察复方小花清风藤对模型大鼠肝组织病理形态、糖原及核酸合成的影响。 结论：复方小花清风藤能够显著减轻D-氨基半乳糖所引起的大鼠肝脏损伤，抗脂质过氧化损伤，并改善肝脏的合成功能。 3复方小花清风藤对卡介苗联合脂多糖致小鼠免疫性肝损伤模型的保护作用目的：探讨复方小花清风藤对免疫性肝损伤模型小鼠肝细胞膜通透性和肝脏病理形态学改变的影响。 方法：小鼠尾静脉注射卡介苗，12天后尾静脉注射微量的脂多糖，造成免疫性肝损伤，4小时后取血，观察复方小花清风藤对模型小鼠血清中ALT、AST含量及肝脏病理组织形态学的影响。 结论：复方小花清风藤对卡介苗联合脂多糖致小鼠免疫性肝损伤模型有一定的保护作用。 附：小花清风藤的抗病毒实验采用一日龄北京鸭静脉注射乙型肝炎病毒，7天后开始给鸭口服小花清风藤不同部位提取物，并以拉米夫定为对照药，观察药物对肝炎鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果。实验结果表明：小花清风藤提取物1-2g/kg，一日2次，连续10日，对肝炎鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果显著，P＜0.05-0.01，且无毒副反应。 第二部分复方小花清风藤对肝损伤炎症干预作用的机制研究1复方小花清风藤对细胞因子表达的影响目的：研究复方小花清风藤对D-氨基半乳糖致肝损伤模型大鼠及免疫性肝损伤模型小鼠血清中细胞因子表达的影响。方法：采用D-氨基半乳糖致大鼠肝损伤模型，卡介苗联合脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤模型，取血，分离血清，采用ELISA方法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-18的含量。结果：复方小花清风藤各剂量能显著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-18的含量。结论：复方小花清风藤可显著抑制肝脏损伤后炎性细胞因子的高水平表达。 2复方小花清风藤对肝细胞凋亡的影响目的：研究复方小花清风藤对免疫性肝损伤模型小鼠肝组织Fas、FasL、Bcl-2、Bax的表达情况及肝细胞凋亡情况的影响，探讨其可能的抗肝细胞凋亡作用和作用环节。 方法：用卡介苗联合脂多糖诱导小鼠的免疫性肝损伤模型，4小时后取肝脏，石蜡包埋切片，进行TUNEL染色处理，以及Fas、FasL、Bcl-2、Bax的免疫组织化学染色，并作图像分析。 结论：复方小花清风藤对免疫性肝损伤模型小鼠肝脏的细胞凋亡有一定的抑制作用。 3复方小花清风藤对D-氨基半乳糖致肝损伤模型大鼠肝组织核转录因子表达的影响目的：研究复方小花清风藤对D-氨基半乳糖致肝损伤模型大鼠肝组织核转录因子NF-κB、PPARα及PPARγ表达的影响，探讨其对炎症机制中转录因子的调节作用。 方法：用D-氨基半乳糖诱导大鼠的肝损伤模型，24小时后取右叶肝脏，石蜡包埋切片，采用免疫组织化学染色法，观察肝组织核转录因子NF-κB、PPARα及PPARγ的表达情况。 结论：复方小花清风藤可抑制肝脏损伤后NF-κB的异常活化，上调PPARα及PPARγ的表达。 4复方小花清风藤对免疫性肝损伤模型小鼠肝组织c-mycmRNA及p38MAPK表达的影响目的：研究复方小花清风藤对免疫性肝损伤模型小鼠肝组织p38MAPK以及c-mycmRNA表达的影响，探讨其抗肝损伤和肝细胞凋亡的可能作用环节。 方法：用卡介苗联合脂多糖诱发小鼠的免疫性肝损伤模型，4小时后取右叶肝脏，以免疫组织化学染色法观察p38MAPK的表达，以RT-PCR法研究c-mycmRNA的表达。 结论：复方小花清风藤可以抑制免疫性肝损伤模型小鼠肝脏中p38MAPK和c-mycmRNA的表达，这可能是其抗肝损伤和肝细胞凋亡的作用机制之一。 综上所述，复方小花清风藤浸膏能够对抗急性肝损伤过程中转氨酶和胆红素的升高，增强肝脏对糖原和蛋白质的合成，减轻脂质过氧化损伤、有一定的保肝作用。其主要的作用机理可能和抑制炎性细胞因子的表达、NF-κB的异常活化，抑制p38MAPK和c-mycmRNA的表达，上调PPARα及PPARγ的表达，抑制肝细胞凋亡等有关。 本课题的创新点： 1.苗药小花清风藤在民间多用于治疗肝炎，疗效确切，但是报道小花清风藤药理作用的相关文献极少，只有部分文献介绍了对其化学成分的研究。关于小花清风藤保肝作用的动物实验及药理研究，尚未见报道。本课题对复方小花清风藤抗急性肝损伤的作用效果及其对炎症的干预作用进行了探讨。 2.D-氨基半乳糖致肝损伤模型是一个常用模型，本课题对D-氨基半乳糖致大鼠肝损伤模型中PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)及核转录因子NF-κB的表达及药物干预作用的实验研究国内尚未见报道。 3.本课题对BCG/LPS致免疫性肝损伤模型中c-mycmRNA表达、p38MAPK表达及药物干预作用的实验研究国内尚未见报道，国外报道也极少。

目录

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缩略词表

国内外研究进展

综述一乙肝的炎症发病机制及相关实验研究进展

综述二病毒性肝炎的中医病因病机及复方小花清风藤主要组成中药的研究进展

参考文献

前言

第一部分复方小花清风藤对急性肝损伤模型的保护作用

实验一复方小花清风藤对CCL4、ANIT致小鼠肝损伤模型的保护作用

实验二复方小花清风藤对D-氨基半乳糖致大鼠肝损伤模型的保护作用

实验三复方小花清风藤对小鼠免疫性肝损伤模型的保护作用

第二部分复方小花清风藤对肝损伤炎症干预作用的机制研究

实验一复方小花清风藤对细胞因子表达的影响

实验二复方小花清风藤对肝细胞凋亡的影响

实验三复方小花清风藤对核转录因子表达的影响

实验四复方小花清风藤对c-myc mRNA及p38MAPK表达的影响

结语

致谢

个人简历

附图一

附图二

附图三

附图四