中药复方颈舒片治疗大鼠神经根型颈椎病的实验研究

摘要

颈椎病是导致外周神经退行性变的常见疾病，原本是中老年的常见病和多发病，但近年来，由于人们生活习惯的改变和诊断技术提高等原因，该病的发病年龄有不断下降的趋势，已不单纯是中老年病了。颈椎病各种分型中，神经根型颈椎病在临床上最多见，呈慢性经过，反复发作。该病属中医痹证和痿证范畴。目前已有研究发现，颈椎病的发病和进展同炎症因素关系十分密切。 复方颈舒片(FFJST)是多年经验方结合现代工艺加工而成的新药，由川芎、白芷、天麻、狗脊和杭菊花组成，经临床观察，该方具有疏风活血，强筋壮骨、通络止痛的作用，尤其在颈椎病神经根型患肢麻木疼痛的治疗方面，有确切疗效。 本研究采用生物电测定、酶联免疫分析、放射免疫测定、免疫组织化学、实时荧光定量聚合酶链反应等手段，从胶质细胞的激活、炎性细胞因子表达、环氧合酶激活以及转录因子活化等炎症环节探讨了复方颈舒片对神经根型颈椎病模型大鼠炎症反应的干预作用及可能的作用机理。 1卡压性神经根型颈椎病模型的建立目的：建立快速、准确、简单、经济的急性神经根型颈椎病模型。 方法：采用椎管插线法，对大鼠颈髓背根神经造成持续卡压，建立神经根型颈椎病动物模型。并对造模后大鼠的一般情况，运动功能，感觉功能，以及局部脊髓、后根、神经节等部位的病理改变等进行了系统观察。 结论：利用椎管插线法，可以使大鼠出现明显的感觉神经系统障碍的表现。这与临床神经根受压后出现的疼痛、感觉异常等神经根功能紊乱的症状和体征十分类似。 在后期的深入研究中，大体选择了造模后3天、7天、14天这3个时间点进行相关指标的观察。研究过程中发现，本模型症状出现(痛觉过敏、髓鞘结构和功能改变、胶质细胞激活等等)较早，3天即可见到明显改变，并且持续稳定发展到术后14天。症状的早期出现，这同局部组织中炎症细胞因子(IL-1β、IL-6)早期(术后3天)增多有关。症状的持续进行，同细胞信号转导通路各关键蛋白质的表达持续增多有关。除了NF-κB在术后7天才有明显表达外，其他IκB、IKK、JAK1、STAT3、SOCA3mRNA等表达均较早而且持久，可以持续到造模后14天，这些蛋白是调节与疼痛密切相关的物质(IL-6，COX-2等)的转录以及持续释放的重要物质，而后者又是导致根性痛的直接原因。这从一个层次上说明了本模型痛觉敏感比较突出而且持久的原因。因此该法可以作为研究急性期神经根型颈椎病和神经根性疼痛的研究模型。 同其他化学性炎症模型不同的是，本模型炎细胞(如白细胞、巨噬细胞)浸润的现象并不突出。这可能与血液中PGE2，组织中的COXmRNA的升高均出现在7天以后有关。说明本模型造成的炎症和化学物质刺激造成的炎症不尽相同，主要是通过胶质细胞和细胞因子的作用实现的，而白细胞等炎性细胞作用居于次要地位。 2复方颈舒片对不同外周神经疼痛模型感觉功能的影响目的：观察复方颈舒片对不同外周神经疼痛模型感觉神经系统功能的影响。 方法：采用生物电测定，测量药物对颈椎插线法大鼠模型正中神经体感诱发电位(SEP)传导时间的影响。同时利用坐骨神经结扎和颈椎插线法建立大鼠外周神经疼痛模型，分别测量该药物对机械压痛的耐受阈值的影响。 结论：复方颈舒片具有明显的提高感觉神经传导性和一定的改善痛觉敏感的作用。 3复方颈舒片对神经根型颈椎病模型神经胶质细胞的影响目的：观察该药对神经根型颈椎病大鼠脊髓中枢和外周神经主要神经胶质细胞星形胶质细胞和雪旺氏细胞的结构和功能影响。 方法：利用椎管插线法建立大鼠神经根型颈椎病模型，用快兰染色观察中枢和外周神经髓鞘的完整情况，利用免疫组化法观察与髓鞘结构密切相关的髓鞘碱性蛋白(MBP)和星形胶质细胞特有的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。 结论：复方颈舒片能保护神经髓鞘，抑制后根神经受压后引起的中枢和外周脱髓鞘反应，抑制中枢星形胶质细胞的激活。 4复方颈舒片对神经根型颈椎病模型炎症细胞因子表达的影响目的：观察该药对神经根型颈椎病大鼠局部神经组织内炎症细胞因子含量及其mRNA表达的影响。 方法：利用椎管插线法建立大鼠神经根型颈椎病模型，造模给药后3天，制作局部神经组织匀浆，取上清液以ELISA法测定其中IL-1β、IL-6的含量；造模及给药后7天、14天，取局部神经组织以实时荧光定量PCR技术，测定IL-6mRNA的表达情况。 结论：复方颈舒片能显著降低局部神经根受压后所导致的神经组织炎性细胞因子的高水平表达。 5复方颈舒片对神经根型颈椎病模型环氧合酶表达的影响目的：研究该药对神经根型颈椎病模型大鼠血浆前列腺素E2(PGE2)的含量以及局部神经组织环氧合酶2(COX-2)蛋白和mRNA表达的影响。方法：造模后3天、7天、14天，分别从大鼠颈总动脉取血，分离血浆，以放射免疫法测定PGE2的含量；取造模后7天、14天压线局部脊髓组织石蜡切片，以免疫组织化学方法观察COX-2蛋白表达；取7天、14天取局部神经组织制成组织匀浆，以实时荧光定量PCR技术，测COX-2mRNA的表达。结果：血浆中的PGE2在术后7、14天明显增高，中药大、中剂量组能明显降低PGE2含量。COX-2在假手术组仅有少量表达，模型组则呈大量表达，阳性表达面积与积分光密度明显增加；药物治疗后COX-2表达面积均有不同程度明显降低，中药大、中剂量组对IOD值也有较明显的降低作用。手术后7天，模型组COX-2mRNA表达显著升高，中药大剂量组可下调COX-2mRNA的表达。术后14天，模型组COX-2mRNA表达含量下降，和假手术组相比差异已不明显。结论：复方颈舒片能抑制COX-2的异常表达及激活，降低PGE2的合成和释放。 6复方颈舒片对神经根型颈椎病模型NF-κB/IκB信号传导因子的调控目的：研究该药对神经根型颈椎病模型大鼠局部神经组织中NF-κB、IκB、IKK表达的影响。 方法：造模后3天、7天、14天，取压线局部脊髓组织石蜡切片，以免疫组织化学方法观察NF-κB、IκB、IKKα蛋白的表达，并做图像分析。 结论：复方颈舒片能抑制核转录因子NF-κB的活化和核易位现象。这种作用同它能够抑制IKK的活性，减少IκB的水解，增强NF-κB/IκB复合物的稳定性有关。 7复方颈舒片对神经根型颈椎病模型JAK/STAT信号转导通路的调控目的：研究该药对神经根型颈椎病模型大鼠局部组织中JAK1、STAT3表达以及JAK/STAT通路负反馈调节因子SOCS1和SOCS3的mRNA的表达量的影响。 方法：造模后3天、7天、14天，取压线局部脊髓组织石蜡切片，以免疫组织化学方法观察JAK1、STAT3蛋白的表达，并做图像分析。造模后7天、14天，取局部神经组织制成组织匀浆，以实时荧光定量PCR技术，测SOCS1mRNA和SOCS3mRNA的相对含量。 结论：复方颈舒片能抑制JAK/STAT细胞信号转导通路的活化，这种作用可能与它能提高此通路的负反馈调节因子SOCS3的表达有关。 综上所述：椎管插线法可以建立急性卡压性神经根型颈椎病模型，主要是通过胶质细胞来激发和维持炎症发生的过程，炎性细胞(如白细胞、巨噬细胞)仅居次要地位；复方颈舒片对神经根受压迫后痛觉过敏、中枢和外周脱髓鞘改变以及胶质细胞激活、炎性相关活性物质释放等炎症反应具有较为明显的对抗作用；通过抑制IKK活性，抑制NF-κB的异常活化以及增强SOCS1的表达，抑制STAT3的异常活化，进而下调炎性细胞因子和环氧合酶的表达，可能是其主要的作用机理。 本课题的创新点：本课题单纯地利用物理卡压建立了椎管插线法的颈椎病模型，探讨了该模型的发病机制和病理变化规律，重点观察了胶质细胞在炎症中的作用；着重探讨了神经根型颈椎病发病过程中两大同IL-6密切相关的细胞信号转导通路——NF-κB/IκB和JAK/STAT的变化以及药物干预机制。对IL-6mRNA、JAK1、STAT3、SOCS3mRNA等物质以及神经胶质细胞在神经根型颈椎病发病及治疗方面的实验研究，国内未见报道，为本研究创新之处。

目录

独创性声明及关于论文使用授权的说明

英文缩略词

综述一颈椎病模型的研究进展

综述二神经根性颈椎病的细胞分子炎症机制研究进展

前言

第一部分卡压性神经根型颈椎病模型的建立

第二部分复方颈舒片对不同外周神经疼痛模型感觉功能的影响

第三部分复方颈舒片对神经根型颈椎病模型神经胶质细胞的影响

第四部分复方颈舒片对神经根型颈椎病模型炎性细胞因子表达的影响

第五部分复方颈舒片对神经根型颈椎病模型环氧合酶表达的影响

第六部分复方颈舒片对神经根型颈椎病模型NF-κB/IκB信号传导因子的调控

第七部分复方颈舒片对神经根型颈椎病模型JAK/STAT信号转导通路的调控

结语

中药复方颈舒片对神经根型颈椎病模型的作用机制图

致谢

个人简历

附图一（1-3）

附图二（4-6）

附图三（7-9）

附图四（10-12）

附图五（13-14）