十种中药植物雌激素样作用及其机制的研究

摘要

雌激素(estrogen)是女性体内关键性的调节激素，不仅对女性生殖系统的生长、发育、分化有重要的调控作用，而且对骨骼系统、心血管系统、中枢神经系统的正常功能也有重要影响。女性进入绝经期后，随着卵巢功能的衰退和体内雌激素水平的下降，女性将出现更年期综合征，骨质疏松、心血管疾病、老年性痴呆等疾病的发病率也随之上升；而雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)虽然可明显缓解上述更年期症状，但长期应用雌激素易产生高血凝状态、高血压、水肿、痴呆等副作用，并增加乳腺癌及子宫内膜癌等妇科肿瘤的发病危险。因此，人们一直致力于寻求雌激素替代物，期望这种替代物既能发挥雌激素对心脑血管等系统的保护作用，缓解更年期综合症；同时又能避免上述副作用，植物雌激素(phytoestrogen)正是其中的重要一类。 植物雌激素是天然存在于一些植物中、具有雌激素效能的化合物。因与雌激素结构类似，这些化合物可以与体内雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合并显示雌激素样活性。植物雌激素在体内具有双向调节作用：在体内雌激素水平较低时有拟雌激素作用；当体内雌激素水平较高时可发挥抗雌激素活性。因此，近年来植物雌激素又被称为“选择性雌激素受体调节剂”(selective estrogen receptor modulators，SERMs)。 长期以来，许多中草药植物被广泛应用于妇女保健和妇科病症的治疗，这些中药所含的植物雌激素在其中发挥的药效作用不容忽视。在含有植物雌激素成分的中药中，活血化瘀类和补益类中药居各类中药的前二位。本研究选取了其中的十种中药及其所含的部分活性成分作为研究对象，利用整体动物实验、体外细胞培养并结合报告基因检测技术观察比较了它们的植物雌激素样作用，探讨了其可能的作用机制及其影响因素；为妇科临床用药提供实验基础，为更年期妇女保健提供理论依据。 1、利用小鼠子宫增重法对十种妇科常用中药(川牛膝、红花、丹参、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂和菟丝子)进行雌激素样作用的筛选 通过观察用药前后小鼠子宫系数和体重变化情况，评价淫羊藿等十种中药的雌激素样作用；并利用Elisa法测定血清E<,2>、FSH、LH水平的变化，免疫组化法检测小鼠子宫组织ERα和ERβ的表达情况。 2、MCF7细胞增殖实验评价红花等十种中药的植物雌激素活性 利用ER阳性MCF7细胞，单独灌胃中药免煎剂或同时灌胃己烯雌酚和中药免煎剂，以MTT法检测红花、川牛膝、丹参、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等十味中药含药血清对细胞增殖的影响；评价十味中药的植物雌激素活性。结果：红花、川牛膝、丹参、枸杞、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂和菟丝子等中药含药血清可显著促进MCF7细胞增殖；而女贞子组可见细胞增殖受到明显抑制。在拮抗实验中，红花、川牛膝、丹参、甘草、淫羊藿、补骨脂和菟丝子组可见己烯雌酚促细胞增殖的作用受到了显著抑制；而肉苁蓉可协同并显著增强己烯雌酚促细胞增殖的作用。 3、补骨脂等五种中药植物雌激素活性的实验研究 利用大鼠子宫增重实验及检测含药血清影响ER阳性MCF7细胞增殖的方法评价五种中药的植物雌激素活性。 4、四种中药和六种中药活性成分植物雌激素作用的比较研究 采用MTT细胞增殖实验观察四种中药：川牛膝、红花、丹参、补骨脂及其所含六种活性成分：蜕皮甾酮、红花黄色素A、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、补骨脂素、异补骨脂素对雌激素受体阳性细胞MCF7增殖的影响，并以雌激素受体拮抗剂ICl182,780干预，探讨其发挥雌激素样作用的可能机制。 5、异补骨脂素和蜕皮甾酮对人乳腺癌T47D细胞增殖及ER亚型、pS2、PR表达的影响利用人乳腺癌T47D细胞观察异补骨脂素和蜕皮甾酮对雌激素受体阳性细胞T47D增殖的作用，并检测其对T47D细胞雌激素受体亚型ER-α、ER-β和雌激素效应基因pS2及PR表达的影响。 6、补骨脂素的植物雌激素作用及其机制的探讨 利用人乳腺癌T47D细胞观察补骨脂素的雌激素样作用，并探讨其可能的作用机制。具体方法为：利用MTT细胞增殖实验观察补骨脂素对ERα、ERβ阳性细胞T47D增殖的影响：以半定量RT-PCR法检测其对该细胞雌激素效应基因：孕激素受体(PR)mRNA表达情况的影响。同时，以雌激素受体拮抗剂IC1182，780为工具药进行干预；并通过流式细胞术检测细胞ERα、ERβ、PR含量的变化。 7、基于报告基因方法对中药活性成分植物雌激素作用的比较研究 通过重组荧光素酶报告基因技术比较研究蜕皮甾酮、补骨脂素、异补骨脂素的植物雌激素作用及其可能机制。 结论: l、整体动物实验结果显示：实验检测的十种中药均具有一定的植物雌激素活性或搞雌激素活性；但其作用靶器官、作用强度和途径有所差异。 2、对药物血清的雌激素活性进行检测时发现：红花、川牛膝、丹参、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等六种中药在单独用药时均表现出拟雌激素作用，在与雌激素同时用药时表现抗雌激素作用；其双向调节效应依赖于体内雌激素水平的高低。 3、中药川牛膝、红花、补骨脂、丹参及其活性成分：蜕皮甾酮、红花黄色素A、补骨脂素、异补骨脂素能够促进ER(+)MCF7细胞增殖，而丹参的两种活性成分：丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA可抑制MCF7细胞增殖，其作用均是通过ER介导的。 4、异补骨脂素和蜕皮甾酮可促进ER(+)T47D细胞增殖，并可影响靶细胞ER亚型、pS2的mRNA表达水平和ER亚型、PR蛋白的表达；异补骨脂素和蜕皮甾酮具有植物雌激素作用。 5、补骨脂素可促进ER(+)T47D细胞增殖，增强ER亚型和PR的表达，且其作用可被ICI182,780拮抗；补骨脂素具有植物雌激素作用。 6、重组荧光素酶报告基因实验证明：蜕皮甾酮、补骨脂素、异补骨脂素均具有植物雌激素样作用，但其作用强度明显低于雌激素，且它们对ERβ的亲和力大于ERα。

目录

论文说明：英文缩略词语表

第一部分：文献综述

综述一植物雌激素的分类及其生理功能

综述二植物雌激素作用机制的研究现状及有关进展

综述三植物雌激素的作用及其作用机制的研究方法

综述四具有植物雌激素作用的方药

第二部分：实验研究

实验一用小鼠子宫增重法筛选红花等十味中药雌激素样活性的实验研究

实验二MCF7细胞增殖实验评价红花等十味中药的植物雌激素活性

实验三补骨脂等五种中药植物雌激素活性的实验研究

实验四四种中药及其所含六种活性成分植物雌激素作用的比较研究

实验五异补骨脂素和蜕皮甾酮对人乳腺癌T47D细胞增殖及ER亚型、pS2、PR表达的影响

实验六补骨脂素的植物雌激素作用及其机制的探讨

实验七基于报告基因方法对中药活性成分植物雌激素样作用的比较研究

结论

创新点

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致谢

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