鲜地黄等十种中药雌激素样作用的实验研究

摘要

随着年龄的增长,卵巢功能衰竭和体内雌激素水平下降,月经开始紊乱甚至闭经,妇女逐渐进入围绝经期,通常在45~55岁发生,妇女进入围绝经期后将会有一系列疾病及症状的发生,如月经紊乱,情绪不稳定,潮红潮热,骨质疏松、老年痴呆、心血管疾病等。
　　长期以来,雌激素替代疗法(Estrogen replacement therapy, ERT)在治疗围绝经期症状方面起到一定的作用,它可以缓解由于雌激素下降引起的各种症状,降低骨质疏松性骨折和脑梗的发生率。但长期应用人工合成雌激素会诱发子宫内膜癌、乳腺癌等疾病的发病。
　　植物雌激素(phytoestrogens)存在于一些天然植物中,具有雌激素样作用。因与雌激素结构类似,植物雌激素可以与体内雌激素受体(estrogen receptors, ERs)和雌激素相关受体(estrogen relation receptor, ERR)结合起到双向调节雌激素受体作用,显示出雌激素样活性。在体内雌激素水平较低时有拟雌激素样作用；当体内雌激素水平较高时,可通过竞争性与雌激素受体结合,抑制内源性雌激素的作用而产生抗雌激素活性。因此,植物雌激素被称为天然的选择性雌激素受体调节剂。
　　本课题采用小鼠子宫增重实验,从九种中药中筛选具有雌激素样活性的中药,结合MCF-7细胞增殖拮抗实验和报告基因技术初步探讨其发挥雌激素样作用的机制；以鲜地黄、生地黄、熟地黄、和鲜地黄汁为研究对象,利用小鼠子宫增重实验对雌激素活性及活性部位进行筛选,采用MCF-7细胞增殖拮抗实验、报告基因技术和免疫印迹法探讨鲜地黄发挥雌激素样作用的机制；为了探讨鲜地黄对成骨功能的影响,本课题以人成骨肉瘤细胞MG63为细胞模型,评价鲜地黄有效部位对MG63细胞增殖及ALP活性的影响,初步探讨鲜地黄有效部位提高成骨活性的作用机制。
　　第一部分：地骨皮等九种中药雌激素样活性筛选的实验研究
　　目的：对选定的九种中药进行雌激素样活性筛选研究。
　　方法：采用小鼠子宫增重实验,观察用药前后小鼠子宫系数,脾脏、胸腺系数及体重变化情况,从而筛选具有雌激素样活性的中药；结合MCF-7细胞增殖实验、MCF-7细胞增殖拮抗实验以及ERE调控的报告基因瞬时表达检测,评价活性中药的雌激素样活性,并初步探讨其作用机制。
　　结果：地骨皮和牛膝水提物能显著增加小鼠子宫系数(P<0.01),而其它七种水提与空白组相比无显著性差异(P>0.05)。
　　地骨皮水提物(10-4 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)及牛膝水提物(10-3 mg·mL-1~1 mg·mL-1)可显著促进MCF-7细胞增殖,加入雌激素受体拮抗剂ICI182,780后,细胞增殖作用均被明显抑制,与空白对照组相比无显著性差异。
　　报告基因瞬时表达检测结果显示：由ERα介导时,地骨皮水提物1 mg·mL-1组荧光素酶活性显著高于空白组；牛膝水提物各剂量组与空白组比无统计学差异。由 ERβ介导时,地骨皮各剂量组荧光素酶活性均显著升高,与空白组相比具有统计学差异,其中,10-1 mg·mL-1和 1 mg·mL-1剂量组与空白组相比具有极显著性差异。牛膝 10-3 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1组荧光素酶活性明显低于空白组,其在浓度10-3 mg·mL-1和10-2 mg·mL-1时与空白组比具有极显著性差异(P<0.01)。
　　结论：地骨皮和牛膝可通过雌激素受体(ER)途径发挥其活性,地骨皮主要是通过ERβ亚型介导促进下游基因的表达发挥雌激素样作用,而牛膝主要是通过ERβ亚型介导抑制下游基因表达发挥雌激素拮抗效应。
　　第二部分：鲜地黄雌激素样作用的实验研究
　　目的：对鲜地黄、生地黄、熟地黄及鲜地黄汁进行体内雌激素样活性筛选；并对鲜地黄进行活性部位筛选,初步探讨其作用机制。
　　方法：同第一部分,并结合免疫印迹法(western blot)。
　　结果：小鼠子宫增重实验：生地黄水提物和鲜地黄水提物显著增加小鼠子宫系数(P<0.01),而熟地黄、地黄叶和鲜地黄汁组与空白对照组相比无统计学差异；鲜地黄醇提物各剂量组显著增加小鼠子宫系数,其中鲜地黄醇提物中剂量组小鼠子宫系数与空白组相比有极显著性差异(P<0.01)；而鲜地黄药渣水提物与空白组相比无显著性差异。
　　MCF-7增殖拮抗实验：24 h和48 h时,鲜地黄醇提物(10-4 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)显著促进MCF-7细胞增殖,而72 h时,鲜地黄醇提物(10-4 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)促MCF-7细胞增殖作用显著下降,与空白组比较无显著性差异。48 h时,ICI182, 780显著性抑制鲜地黄醇提物各剂量组促MCF-7细胞增殖。
　　报告基因结果显示：由ERα介导时,鲜地黄醇提物1 mg·mL-1标准化后荧光素酶活性显著性高于空白组(P<0.01)；由ERβ介导时,鲜地黄醇提物10-3 mg·mL-1、10-1 mg·mL-1、1 mg·mL-1组标准化后的荧光素酶活性显著升高,其中,10-1 mg·mL-1、1 mg·mL-1组与空白组比较具有极显著性差异(P<0.01)。
　　Western blot结果显示：鲜地黄醇提物1 mg·mL-1时明显促进MCF-7细胞ERα蛋白的表达,与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；鲜地黄醇提物(0.001 mg·mL-1~0.1 mg·mL-1)各剂量组均能显著促进ERβ蛋白的表达,与空白对照组比有极显著性差异(P<0.01)。
　　结论：鲜地黄和生地黄具有雌激素样活性,其中鲜地黄醇提物是其发挥雌激素样作用的活性部位。鲜地黄醇提物是通过雌激素受体ER介导而发挥雌激素样作用,且主要是通过ERβ亚型介导,并可显著提高MCF-7细胞ERβ蛋白的表达,对ERα蛋白表达影响较小。
　　第三部分：鲜地黄活性部位对成骨细胞增殖和成骨活性影响的实验研究
　　目的：探讨鲜地黄活性部位对成骨活性的影响。
　　方法：用MTT增殖实验检测鲜地黄醇提物对MG63细胞增殖的影响,并用检测试剂盒检测鲜地黄醇提物及ICI182, 780和胞外信号调节激酶(ERK)阻断剂U0126干预后对MG63细胞ALP活性的影响。
　　结果：MG63增殖实验：24h和36h时,鲜地黄醇提物(0.001 mg·mL-1~0.1 mg·mL-1)显著促进MG63细胞增殖(P<0.01),72h时,鲜地黄醇提物各剂量组均抑制MG63细胞增殖,与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01),且呈剂量依赖性。
　　ALP活性检测：24h、48h和72h时鲜地黄醇提物(10-3 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)均能显著促进MG63碱性磷酸酶活性(ALP)增加,且与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01),96h时,鲜地黄醇提物各剂量组促MG63碱性磷酸酶活性(ALP)作用消失,与空白组相比无统计学差异。ICI182, 780和U0126均能显著抑制鲜地黄醇提物促MG63碱性磷酸酶活性。
　　结论：鲜地黄醇提物可促进人成骨肉瘤细胞(MG63)增殖和碱性磷酸酶活性增加,且其可能是通过雌激素受体(ER)途径和胞外信号调节激酶(ERK)途径提高MG63细胞ALP活性,进而促进成骨活性。

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英文摘要

第一部分 地骨皮等九种中药雌激素样活性筛选的实验研究

前言

实验1 地骨皮等九种中药雌激素样活性筛选研究

实验2 地骨皮和牛膝雌激素样作用的实验研究

讨论

参考文献

第二部分 鲜地黄雌激素样作用的实验研究

前言

实验3 怀地黄雌激素样活性筛选研究

实验4 鲜地黄雌激素样作用的实验研究

讨论

参考文献

第三部分鲜地黄活性部位对成骨细胞增殖及成骨活性影响的实验研究

前言

实验5 鲜地黄醇提物对人骨肉瘤细胞(MG63)增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性影响的研究

讨论

参考文献

致谢

附录1：

附录2：