实验用鱼遗传检测方法的建立——对斑马鱼、剑尾鱼遗传检测方法的研究

摘要

实验用鱼是一类重要的实验动物，其中斑马鱼（Danio rerio）和有“环境监测器”之称的剑尾鱼（Xiphophorus helleri）在生命科学的诸多领域发挥着不可或缺的作用。虽然这些实验用鱼的功能学研究开展较早，但涉及遗传质量控制基础的遗传监测研究较为少见。建立相应的遗传检测方法，对其进行遗传质量控制，保证实验用鱼质量稳定、结果可靠，是亟待解决的问题。
　　本课题应用生化标记和DNA分子标记技术，通过乙酸纤维素薄膜的同工酶电泳、RAPD随机扩增、STR扩增的方法，尝试从蛋白水平和核酸水平建立实验用鱼的遗传检测方法。以封闭群斑马鱼（AB、LF、本地短尾（short tail，ST）各20尾）和近交系剑尾鱼（RR-B、RW-H、BY-F各6尾）为实验材料进行研究。同时以近交系剑尾鱼为标准，用6尾非选育剑尾鱼进行了方法的重复性验证。
　　经过研究，在蛋白水平上，斑马鱼肌肉来源同工酶在6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Gpd）、过氧化氢酶（Ce）、苹果酸脱氢酶（Mod）、葡萄糖磷酸异构酶（Gpi）、酯酶（ES）这5个生化位点在三种群中均表现出多态性。经卡方检验分析，Gpd、Gpi位点群间差异显著（P<0.01），Ce、Mod有群间差异（P<0.05）。对近交系剑尾鱼进行了眼睛、肝脏、肌肉的组织特异性研究，发现大部分酶在肝脏中活性较强。选用代表组织进行分析，同一生化位点在各品系内表现较为一致。在Gpi、Gpd位点RR-B系表现出特异性条带，RW-H系在Ce位点表现出特异性条带。非选育剑尾鱼在Gpi、Gpd、Ce位点表现出多态性。
　　在DNA水平上，经过优化PCR反应条件，扩增筛选了RAPD引物。在斑马鱼和剑尾鱼中，分别得到5条和11条稳定性较好的对随机引物。图谱直观分析，斑马鱼AB群在SJD3的随机扩增产物主带集中在700bp～900bp之间，而ST、LF群的扩增产物2条主带均在1000bp以上。剑尾鱼RR-B系在P30和S97扩增产物中表现出特异条带。RR-B系 P30扩增产物存在约1500bp的特异主带，在S97的扩增产物存在300bp至400bp之间的一条特异主带，可直接判读与其他品系的差异。按照Nei's原理与生物多样性分析方法，利用Popgen32软件分析得到Shannon's指数Nei基因多样性指数（h）均有AB>LF>ST。两两比较分析遗传距离（D）得出 DST&LF<0.2　　其次，在斑马鱼、剑尾鱼中分别筛选了24对和26对STR引物，均得到4对稳定的STR引物。在斑马鱼中，Z9384、Z10508、Z20046这3对引物在群内和群间均表现出多态性。经卡方检验，Z20046群间差异显著（P<0.01），Z9384有群间差异（P<0.05），Z10508扩增结果无统计学差异（P>0.05）。在剑尾鱼中，引物AY204223的扩增条带表现出多态性，在RR-B与BY-F系表型一致，且与RW-H表型不同。在该微卫星克隆位点，非选育剑尾鱼亦表现出多态性条带。
　　本研究还对两种实验用鱼中丽春红染色一种蛋白标记进行初步探讨。该蛋白在封闭群斑马鱼群间表现无差异，在近交系剑尾鱼中，仅RR-B系表现出特异谱带，非选育剑尾鱼表现多态性谱带。对该蛋白的从属定性还有待更深入研究。
　　综上，建立的生化标记具有较好重复性，操作简便，结果易判读，可作为斑马鱼和剑尾鱼的遗传生化标记方法；利用随机引物和微卫星引物从基因水平初步建立了斑马鱼、剑尾鱼的RAPD和STR群体遗传分析方法，为建立实验用鱼的遗传检测技术打下了基础，对实验用鱼的遗传质量控制具有重要意义。

目录

封面

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前言

第一部分 斑马鱼遗传生化标记技术研究

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

第二部分 斑马鱼RAPD标记技术研究

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

第三部分 斑马鱼微卫星STR标记技术研究

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

第四部分 剑尾鱼遗传生化标记技术研究

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

第五部分 近交系剑尾鱼RAPD标记技术研究

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

第六部分 近交系剑尾鱼的STR技术研究

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

第七部分 一种蛋白标记在实验用鱼遗传分析中的初探

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

第八部分 研究总结

参考文献

附录：实验用鱼遗传检测方法汇总

缩略语索引

文献综述

致谢

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