Ca/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ信息通路在阿片依赖的受体信号转导机制中的作用

摘要

该研究采用生化和分子药理学的方法,深入研究Ca<'2+>/钙调蛋白激酶信息通路在阿片依赖中的作用.首先,从牛心肌组织中提取纯化CaMKⅡ,并测定其活性.然后观察δ阿片受体特异性激动剂DPDPE长时程作用于NG108-15细胞,Ca<'2+>/CaMKⅡ信息通路的变化;探讨Ca<'2+>/CaMKⅡ通路的活性与cAMP水平之间的关系,以及Ca<'2+>/CaMKⅡ通路的活性与NOS活性的关系.应用RT-PCR,观察应用DPDPE长时程作用于NG108-15细胞以及应用纳洛酮后,对δ受体表达水平的影响,以探讨阿片依赖的核内机制.该研究不仅阐明在阿片依赖时Ca<'2+>/CaMKⅡ信息通路活性的改变具有重要的理论价值,而且为阿片依赖时Ca<'2+>/CaMKⅡ信息通路与其他信息通路之间的相互作用及核内机制提供了实验依据,也为寻找和设计抗阿片耐受成瘾药物治疗提供了新的研究策略和药物作用靶点.第一部分;从牛心肌提取纯化CaMKⅡ并进行活性测定;第二部分:阿片类药物作用NG108-15细胞48hr,以及加入纳洛酮后对Ca<'2+>/CaMKⅡ信息通路活性的作用;第三部分;阿片类药物作用NG108-15细胞Ca<'2+>/CaMKⅡ信息通路活性与其他信息通路之间的关系;第四部分:阿片类药物长时程作用于NG108-15细胞,观察Ca<'2+>/CaMKⅡ信息通路对δ-阿片受体表达的影响.

目录

缩略词表

前言

材料和方法

一、技术路线

二、实验材料

1.提取CaM及CaMKⅡ

2.细胞、细胞培养及试剂

3.受体激动剂、拮抗剂、工具药

4.CAMP,CaM活性，CaMKⅡ活性测定

5.Western bl2t

6.NOS测定

7.质粒和菌株

8.分子生物学试剂

9.RT-PCR

10.主要仪器

三、实验方法

1.氟奋乃静-sepharose的制备

2.CaM的制备

3.制备CaM-Sepharose 4B交联物(Sharma RK,1990)(Gupta RC,1989)(Sharma Rk,1980)

4.DEAE-cellulose的制备

5.CaMKⅡ的提取(Kakkar,R,1996)

6.提取CaMKⅡ激酶活性测定(Kirchherfer,U,1999)(Yosiaki H,1987)

7.药理实验分组

8.细胞培养

9.CaM活性测定

10.CaMKⅡ活性测定(Kirchhefer U,1999)

11.CaMKⅡ含量测定

12.环磷酸腺苷激酶提取和纯化

13.cAMP水平测定

14.NOS活性测定

15.大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

16.质粒DNA小量制备

17.细胞总RNA的提取

18.甲醛变性电泳法

19.RT-PCR反应

20.蛋白质浓度测定

21.统计方法

第一部分：钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的制备与活性测定

实验结果

一、CaM的提取与纯化

二、CaMKⅡ的提取与纯化

三、CaMKⅡ的SDS-PAGE结果

四、CaMKⅡ提取物的活性测定

讨论

结论

第二部分：阿片类药物对NG108-15细胞Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶信息通路的作用

实验结果

1.DPDPE长时程作用于NG108-15细胞，对cAMP水平的作用

2.DPDPE长时程作用于NG108-15细胞，对CaM活性的作用

3.DPDPE长时程作用于NG108-15细胞，加入 10-5mol·L-1纳洛酮，对CaM活性的作用

4. DPDPE长时程作用于NG108-15细胞，对CaMKⅡ活性的作用

5.DPE长时程作用于NG108-15细胞，加入10-5mol·L-1纳洛酮，对CaMKⅡ活性的作用

6.DPDPE长时程作用于NG108-15细胞，对CaMKⅡ含量的作用

讨论

结论

第三部分Ca2+/CaMK信息通路与其他信息通路之间的关系

实验结果

1.DPDPE、DPDPE+W-7、DPDPE+KN-KN-62作用于不同细胞株cAMP活性的变化

2.DPDPE长时程作用于不同细胞系CaM活性的改变

3.DPDPE长时程作用于不同细胞系CaMKⅡ活性的改变

4.DPDPE、DPDPE+W-7、DPDPE+KN-62作用于不同细胞株NOS活性的变化

讨论

结论

第四部分：阿片耐受依赖过程中Ca2+/Calmodulin dependent protein kinase 通路对阿片受体水平的调节

实验结果

1.细胞总RNA的提取与鉴定

2.RT-PCR检测NG108-15细胞内mDORmRNA的表达

讨论

结论

参考文献

综述一

综述二

致谢