MEKK2参与和调制T淋巴细胞受体信号转导以及皮质激素对人肺成纤维细胞MAPK的作用

摘要

一、MEKK2参与T细胞受体信号中JNK激活和IL-2基因表达 JNK(c-Jun N-terminal kinases)是MAPK(mitogen-activated protein kinase)家族基因的成员,对细胞增殖、分化和凋亡十分重要.以前的研究发现T细胞JNK激活需要T细胞受体和辅助受体如CD28的共刺激.该研究探讨MEKK2是否是T细胞中特异的JNK上游活化激酶,是否涉及转导来自TCR/CD3的T细胞信号激活JNK MAPK级联和T细胞特异基因IL-2的表达.利用多组织poly(A)杂交模板,用1kb N-末端人MEKK2做探针行Northern杂交.Jurkat T-细胞用电击法转染,COS-1细胞用Lipo-fectamine转染检测不同的基因表达或作用.抗JNK抗体免疫沉淀法,GST-cJun为作用底物体外检测JNK激酶活性;抗HA抗体、GST-JNKK2为作用底物体外检测MEKK2激酶活性.荧光酶报告基因检测IL-2和AP—1基因的表达.抗HA抗体12CA5、抗MEKK2抗体11281129、抗磷酸化抗体Pty20和ECL试剂盒进行蛋白印迹检测.二、小鼠MEKK2基因损毁揭示其在T细胞受体信号转导中起特殊调制作用 MEKK2是丝裂原蛋白激酶(MAPK)激酶的激酶基因家族成员,涉及调节多条MAPK信号途径.MAPK可以被特异的MAPKK在保守的苏氨酸和酪氨酸上双磷酸化而激活,MAPKK则由MAPKKK来激活.为了阐明MEKK2在体内的功能,我们制备了携带靶向突变MEKK2基因座的小鼠,并进行了系列分析.基因打靶制备MEKK2缺陷小鼠,Southern杂交、PCR方法检测基因型.免疫沉淀和蛋白印迹方法分析MEKK2的表达.制备纯化T细胞,荧光抗体常规染色标记,流式细胞仪分析T细胞和B细胞亚群.ELISA方法测定细胞因子IL—2、IL—4、IL—5、IL—10和IFN—r.小鼠腹腔注射抗CD3单抗或对照抗体,检测体内胸腺细胞凋亡.体外分别用抗CD3单抗、抗Fas抗体、地塞米松和紫外线诱导凋亡,PI和FITC—AnnexinV双染检测.免疫印迹法检测磷酸化JNK、ERK和p38,膜经洗脱抗体后再进行常规JNK、ERK和p38蛋白印迹分析.三、激素对人肺成纤维细胞MAPK信号传导途径的作用 激素是控制代谢、发育、炎症、细胞增殖和分化的调控分子.已知激素对多种组织和细胞如淋巴组织、成纤维组织和上皮来源细胞等具有抗增殖作用,临床上常常利用其抗炎作用治疗肺间质性疾病.但是皮质激素导致肺成纤维细胞周期停滞和生长抑制,及其信号传导通路依然不清楚.为了探讨MAPK信号传导通路在地塞米松对于肺成纤维细胞的直接作用,我们用不同浓度的地塞米松作用于培养的肺成纤维细胞,分别采用细胞直接计数法和MTT法测定细胞的增殖,PI染色流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡,用特异的抗磷酸化抗体,蛋白印迹法分别检测JNK、ERK和p38蛋白的磷酸化,用特异的MAPK抗体分别检测相应的JNK、ERK和p38蛋白.

目录

MEKK2参与T细胞受体信号中JNK激活和IL-2基因表达

一、前言

二、材料和方法

1、质粒、蛋白和抗体

2、Northern杂交

3、细胞培养和转染

4、体外激酶JNK和MEKK2活性测定（29）

5、荧光酶素报告基因检测

6、蛋白印迹

三、结果

1、T细胞中MEKK2激活JNK级联

2、MEKK2参与转导T细胞TCR/CD3信号

3、抗CD3抗体刺激时MEKK2的酪氨酸磷酸化

4、T细胞共刺激中JNK激活和IL-2基因表达需要MEKK2参与

四、讨论

五、小结

参考文献

第二部分：小鼠MEKK2基因损毁揭示其在T细胞受体信号转导中起特殊调制作用

一、前言

二、材料和方法

1、基因打靶制备MEKK2缺陷小鼠

2、免疫沉淀和蛋白印迹方法分析

3、T细胞制备和纯化

4、流式细胞仪分析

5、细胞增值检测

6、ELISA测定细胞因子

7、体内胸腺细胞死亡检测

8、体外细胞凋亡检测

9、免疫印迹法检测磷酸化JNK、ERK和p38

10、洗脱和再杂交检测JNK、ERK和p38蛋白

四、结果

1、同源重组损坏MEKK2基因及表达

2、MEKK2突变型小鼠表型

3、MEKK2的损坏不改变正常的T细胞、B细胞发展

4、MEKK2缺陷T细胞在抗CD3单抗刺激时增殖显著

5、MEKK2缺陷型T细胞细胞因子表达的改变

6、MEKK2保护胸腺细胞抵抗激活诱导细胞死亡的作用

7、MEKK2损坏不阻断TCR介导的JNK、ERK和p38的激活

四、讨论

五、小结

参考文献

激素对人肺成纤维细胞MAPK信号传导途径的作用

一、前言

二、材料和方法

1、仪器和试剂

2、细胞培养和处理

3、细胞增殖试验

4、流式细胞仪分析细胞周期

5、蛋白印迹检测JNK、ERK和p38蛋白的磷酸化

6、膜抗体洗脱再杂交

7、蛋白印迹检测JNK、ERK和p38

三、结果

1、地塞米松抑制肺成纤维细胞增殖

2、地塞米松阻断肺成纤维细胞的细胞周期

3、激素对JNK的作用

4、激素对ERK的作用

5、激素对p38的作用

四、讨论

五、小结

参考文献

综述一：丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联及其作用机制

一、引言

二、MAPK途径的发现

三、MAPK途径基本特点（Christian,W,1999）

1、三酶级联反应

2、MAPK的双磷酸化激活

四、ERK1I/2MAPK级联

1、激活因素及上游分子的募集

2、ERK途径三酶模体构成

3、作用底物

4、ERK途径功能

5、ERK途径的调节

五、JNK MAPK级联

1、激活因素及上游分子募集

2、三酶模体构成

3、作用底物

4、途径功能

六、P38 MAPK级联

1、激活因素及上游分子募集

2、三酶模体构成

3、作用底物

4、P38途径的功能

七、MAPK对基因表达的调控

八、MAPK途径特异性的实现

1、酶—底物相互作用（Schaeffer HJ,1999）

2、分子平台

3、胞内作用的空间位置

4、胞内作用的时间顺序

5.信号的交叉与整合

九、MAPK和淋巴细胞的激活

十、结语

参考文献

综述二：核受体和辅调因子对基因表达的组合调控——核受体和辅调因子的相互作用

一、核受体超家族的基本结构

二、核受体的激活功能区(AF-1和AF-2)

三、核受体辅激活子

四、几种辅激活子与核受体的作用

（1）雄激素受体相关蛋白70（ARA70）

（2）中性粒细胞募集抑制因子3（AEA70）

（3）富含谷/天氨酸C-末端的CBP/p300相互作用转激活子（CITED1）

（4）选择性雌激素受体调制子（SERM）

五、核受体辅阻遏子

六、几种辅阻遏子与核受体的相互作用

（1）SMRT与RXR的作用

（2）过氧化体增殖子激活受体δ(PPARδ)

(3)雌激素受体活性阻遏子(RER)

参考文献

缩略词表

致谢