一个新的CD2胞内区结合蛋白的结构与功能的初步研究

摘要

CD2分子是分布于胸腺细胞及所有成熟T淋巴细胞和大部分自然杀伤细胞表面的特征性分化抗原。CD2具有调节T淋巴细胞分化、成熟、激活和凋亡等功能，是介导T细胞抗原识别、粘附和介导淋巴细胞信号传递的重要细胞表面抗原。其富含脯氨酸的，带正电荷的胞内区具有信号传递和细胞粘附调节两种功能，对于CD2的功能至关重要。寻找细胞内可与CD2胞内区相互作用的信号蛋白是CD2分子免疫学功能研究的热点之一。本实验室通过酵母双杂交系统，在人KT3T淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个与CD2胞内区结合的蛋白分子，经与GeneBank数据库比较分析此蛋白为人v-fos转化效应蛋白(Fte-1)，其与人核糖体小亚基蛋白S3a(RPS3a)为同一基因产物。Fte-1由264个氨基酸残基组成，分子量为29.9KD。 Fte-1被认为是一种典型的单基因多功能的蛋白，在多种肿瘤细胞和转化的细胞系中高水平表达。其除了作为核糖体小亚基的一个组成蛋白，参与翻译起始之外，还具有复杂的核糖体外的功能，尤其在调节细胞的存活，凋亡和转化方面具有重要功能。其与CD2的相互作用尚属首次发现。 本论文围绕CD2胞内区和Fte-1的相互作用进行了以下研究： 1.应用IAsyplusAffinitysensor生物大分子相互作用系统在体外研究CD2胞内区和Fte-1的相互作用。证明其确实为特异性的相互结合作用。KD值为2×10-7， 2.将Fte-1蛋白序列提交PROSITE数据库分析，证明其并不包含与蛋白质相互作用相关的特殊结构域。但其含有三个可能的PKC磷酸化位点。 3.体外磷酸化实验证明Fte-1蛋白可被PKC磷酸化。进一步构建包含不同可能PKC磷酸化位点的缺失片段的表达载体，获得各缺失突变的多肽后，进行体外磷酸化实验。证明，Fte-1蛋白只有其C-端的可被磷酸化。将Ser238突变为Gly后，此位点不再被磷酸化。 4.通过体内磷酸化实验进一步验证Fte-1蛋白可被内源性的PKC磷酸化。 5.同时考察缺失片段与CD2胞内区的结合作用，发现当Fte-1蛋白C-端237位之后包含PKC作用位点的片段缺失后，与CD2胞内区不再结合。而N-端缺失对其与CD2胞内区的结合作用没有影响。这证明Fte-1的C-末端对其与CD2胞内区的结合作用非常重要，这可能与PKC的磷酸化作用相关。 6.利用Pulldown方法确证Fte-1与CD2胞内区的相互作用。 7.利用激光共聚焦技术观察到，Fte-1蛋白在细胞内的定位为簇集性的分布，可能与其参与核糖体组成有关。其N-端对其在细胞内的定位很重要，C-端的部分缺失不影响其在细胞内表达后的定位。 8.在抗CD2单克隆抗体T11刺激Jurkat细胞后，Fte-1的定位发生明显变化，与CD2共定位于细胞膜上。提示在细胞内Fte-1与CD2胞内区的结合有赖于CD2介导的细胞激活信号。 9.Fte-1蛋白PKC磷酸化位点的突变使Fte-1失去与CD2分子共定位的能力，说明Fte-1的PKC磷酸化对Fte-1和CD2在T淋巴细胞内的结合至关重要。 单独用PMA刺激细胞，仅使Fte-1失去簇集分布的特征，但并不使其与CD2共定位。推测PKC磷酸化可能是Fte-1与CD2胞内区结合的下游事件，参与了CD2介导的信号传递。 10.使用反义序列或siRNA抑制Fte-1在Jurkat细胞中的表达，可以抑制Jurkat细胞激活后的细胞凋亡。提示Fte-1可能参与对T细胞激活和死亡的调节，其机理可能与Fte-1与CD2的相互作用有关。 本研究证明，Fte-1与CD2在T细胞内特异性结合，参与CD2的信号传递。Fte-1可被PKC磷酸化，该磷酸化位点为Ser238。PKC的磷酸化对于Fte-1与CD2的相互作用及其生物学功能具有重要意义。证实Fte-1是CD2胞内区的结合蛋白，为研究CD2在细胞内的复杂功能，提供了新的方向。

目录

摘要

缩写词表

前言

第一部分 CD2胞内区和Fte-1的相互结合作用研究

实验材料

实验方法

结果与分析

小结

第二部分 Fte-1的PKC磷酸化

第三部分 Fte-1在T淋巴细胞中的定位及功能

实验材料

实验方法

结果与分析

小结

讨论

总结

参考文献

综述一 RPS3a，一个单基因多功能蛋白

综述二 Lipid rafts 在T淋巴细胞中的作用

致谢