利用新型人源打靶载体构建基因定点修复的荧光报告系统

摘要

理想的基因治疗应该具备以下三方面的要求:基因治疗的有效性、基因治疗的靶向性和基因治疗的安全性.近年来出现的寡核苷酸介导的基因定点修复策略,可针对基因位点的缺陷进行原位矫正,使修复的基因能够在其本身的染色质环境和调控序列调节下进行适宜水平的表达,是基因治疗的理想模式,具有比传统策略更明显的优越性.从寡核苷酸修复术的发展过程考虑,本文建立一种灵敏、方便、稳定、可靠的报告系统.实验证明,本系统直接、快速、准确地测定了定点修复事件的发生,结果稳定,为机制研究建立了良好的实验平台.在本系统研究中,发现寡核苷酸的作用表现出明显的链偏向性,即针对正义链的打靶分子起效,而与之互补的另一条打靶分子几乎没有修复作用,支持了Kmiec和Yoon等人提出的SSO作用的转录相关因素.结合本实验室前期研究所发现的提高效率的复制相关因素,我们认为寡核苷酸的定点修复作用是包括转录、复制、错配修复等与细胞功能密切相关的多因素、多环节共同参与、作用的结果,不能简单用一种机制解释.本实验室曾发现经硫代修饰的SSO修复后发光细胞丧失了正常的分裂能力而无法获得纠正后的细胞克隆,因此我们利用新获得的细胞系继续对这一现象进行了观察,初步判断了SSO的修复对细胞分裂能力的影响.在有效提高寡核苷酸介导的基因定点修复效率的基础上,下一步的工作中,我们将利用AS-PCR、PCR-RFLP、DNA测序、Southern blot、Westernblot等多种检测方法,从多水平验证靶位点的特异性改变,在该实验平台基础上,结合本实验室前期工作,进行更加完整而系统的寡核苷酸作用机制的研究.

目录

前言

一基因治疗是在核酸水平上纠正疾病的生物技术

1.基因添加策略——通过病毒载体介导实现基因的有效转移

2.基因修复策略——对缺陷基因实现原位修正

二寡核苷酸介导的基因定点修复策略概述

1.三链形成寡核苷酸

2.杂合寡核苷酸介导的基因定点修复

3.单链寡核苷酸介导的基因定点修复

4.单链寡核苷酸修复术实际应用中的制约因素

三新型人源载体用于构建定点修复机制实验平台的设想

1.新型人源打靶载体——介导基因转移和高效表达的新载体

2.利用新型人源载体构建定点修复机制研究的实验平台

四本研究的课题设计

1.利用新型人源载体构建单点突变的荧光报告系统

2. 使用SSO对荧光报告系统进行定点修复并观察修复效率

3.对寡合苷酸作用中链的偏向性进行分析

4.优化基因定点修复实验体系中的反应条件

5.评估新型人源载体在基因治疗中的可行性

实验材料与方法

一实验材料

1菌株和质粒

2细胞系

3限制性内切酶及其他酶类

4转染试剂

5寡核苷酸

6其他主要试剂和试剂盒

7主要仪器

二实验方法

1实验流程图

2重组体pGEM11MS-mEGFP的构建

3哺乳动物细胞系的培养

4细胞转染

5 PCR分析转染后的Hela细胞

6 SSO修复结果的检测

结果

一 携带突变EGFP基因(mEGFP)的人源打靶载体重组体的构建

1.突变EGFP基因(mEGFP)的获得

2.pmEGFP的酶切鉴定

3.质粒pGEM11MS的扩增和鉴定

4.重组体pGEM11MS-mEGFP的构建

二Hela-重组体细胞株的建立和鉴定

1.转染和克隆的筛选

2.PCR及酶切鉴定

三HeLa-mEGFP混合克隆的定点修复

1.针对mEGFP基因的点突变的打靶分子的设计

2针对mEGFP基因点突变的基因定点修复

讨论

一新型人源载体构建的荧光报告系统用于基因定点修复研究的优越性

1.建立可靠稳定的实验体系是进行机制研究的前提

2.利用新型人源打靶载体构建单点突变的荧光报告系统

3.SSO对该荧光报告系统修复效率的比较

4.该系统为基因定点修复机制的研究提供了较为理想的细胞模型

二寡合苷酸作用中链的偏向性对修复效率的影响

1.SSO对荧光报告系统修复效率差异的比较

2.寡核苷酸作用中链的偏向性分析

三基因定点修复策略研究的发展方向及应用前景

1.提高基因定点修复的效率有赖于机制的进一步阐释

2.基因定点修复术的应用前景

四本实验的不足和改进方法

1.本实验的不足

2.改进方法

小结

参考文献

文献综述

参考文献

英文名词及缩写

致谢

个人简历