应用基因芯片技术筛选胰腺癌放射耐受相关基因

摘要

目的：胰腺癌属高度恶性肿瘤，预后极差。放射治疗是胰腺癌的重要辅助治疗方法，但胰腺癌的放射敏感性较低，并且放疗过程中存在放射抗拒性改变。国内外多项研究表明，胰腺癌细胞对辐射的耐受是复杂的多基因共同作用的结果。为此，本研究拟利用基因芯片技术检测胰腺癌亲本细胞株及耐放射细胞亚株的基因表达谱，之后通过芯片数据分析筛选与胰腺癌细胞放射耐受相关的差异表达基因，并通过对差异表达基因作进一步的生物信息挖掘，探索胰腺癌细胞放射耐受发生的分子机制。 方法：1.应用集落形成实验检测人胰腺癌细胞株SW1990、ASPC及耐放射细胞亚株SW1990/R、ASPC/R的放射敏感性。 2.应用Affymetrix人类全基因组表达谱芯片HGU1332.0plus检测人胰腺癌细胞株SW1990、ASPC及耐放射亚株SW1990/R、ASPC/R的基因表达谱，初步筛选亲本株与耐放射亚株之间的差异表达基因。 3.对差异表达基因进行主成分分析、GO分析及聚类分析，通过Netaffy、NCBI生物医学文献数据库检索基因信息及功能，寻找与胰腺癌细胞放射耐受相关的主效基因，探索放射耐受发生的分子机制。 4.采用相对定量荧光实时PCR技术及蛋白印迹的方法对部分差异表达基因或编码的相应蛋白进行了mRNA及蛋白水平的验证，以确定芯片检测结果的可靠性。 结果：1.胰腺癌耐放射细胞亚株SW1990/R、ASPC/R较亲本株放射敏感性降低，SF2值升高(p＜0.01)。 2.应用基因芯片技术检测胰腺癌细胞株SW1990、ASPC及耐放射细胞亚株SW1990/R、ASPC/R的基因表达谱。在47400个转录本中，通过TwowayANOVA分析得到与放射敏感性相关的统计学差异的基因共2392条，筛选亲本株与耐放射细胞亚株放射敏感性相关的差异在两倍以上的共同差异基因137条。137条基因中已知基因88个，EST序列49个。其中上调表达基因43个，下调表达基因94个。 3.根据GO分类，在137个基因中共有126个基因有完整的功能注释，涉及不同的分子功能分类，并参与了多个生物学过程。根据137条差异表达基因表达谱的相似性，通过双向层次聚类分析，可以将耐放射细胞株与亲本株分开；对基因的聚类分析，发现ERO1L簇、RIS1簇、WNT5A簇及EDN1簇在亲本株与耐放射亚株间表达出现明显的差异。进一步信息挖掘出一些可能与胰腺癌放射耐受密切相关的基因，如：ERO1L、WNT5A、FGFR3、ATRX、RGS4等。 4.应用相对定量荧光实时PCR技术及蛋白印迹的方法对部分差异表达在2倍以上的基因或编码的相应蛋白进行了mRNA及蛋白水平的验证，结果显示实时PCR和蛋白印迹实验结果与芯片结果具有良好的一致性，进一步证实了芯片结果的可靠性。 结论：1.胰腺癌放射耐受的发生为复杂的、多基因协同作用的结果，涉及到DNA损伤修复、细胞周期调控、肿瘤细胞凋亡、信号转导、细胞粘附、应激反应等多种遗传学改变。 2.ERO1L、WNT5A、FGFR3、ATRX、RGS4等基因可能与胰腺癌放射耐受密切相关。对这些基因的进一步研究将有助于理解胰腺癌放射耐受发生的分子机制，为提高胰腺癌放射治疗的敏感性提供新的靶点及策略。

目录

中英文名词及缩写对照

前 言

第一部分胰腺癌放射耐受性相关差异表达基因的筛选

材料

实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

附录一 SW1990与SW1990/R、ASPC与ASPC/R共同的差异2倍以上基因

附录二 基因芯片样本的制备、标记与芯片杂交

第二部分基因芯片检测结果的验证实验

材料

实验方法

结 果

讨论

参考文献：

文献综述 基因芯片与胰腺癌研究

全文小结

致 谢