角质形成细胞表达的Toll样受体在皮肤癣菌感染中的作用初探

摘要

皮肤癣菌是一类常见的人和动物的致病真菌，具有嗜角质性，主要侵及皮肤角质结构而引起角质层、毛发和甲板的感染，是临床常见的病原真菌。由于皮肤癣菌引起皮肤感染发病率和复发率高，是临床亟待解决的问题。探讨皮肤癣菌感染机制尤其是免疫机制，对于皮肤癣菌感染的防治具有重要意义。目前的研究显示，在皮肤癣菌感染机制中，调节性免疫反应产生的保护作用有限，提示局部组织针对皮肤癣菌的天然免疫可能在对抗皮肤癣菌感染中起着更为重要的作用。本研究通过在体外将红色毛癣菌与角质形成细胞系HaCaT共孵育，以初步探讨角质形成细胞表达的天然免疫中重要因子Toll样受体在皮肤癣菌感染中的作用。 首先，我们采用永生化的角质形成细胞(HaCaT)与红色毛癣菌菌丝片段悬液在不含血清的DMEM培养基中5％CO2环境下，37℃共孵育，以无细胞的不含血清DMEM培养基稀释的菌丝段悬液作为阴性对照。共孵育4小时、8小时、16小时和24小时分别吸取菌丝段悬液进行台盼蓝染色计数和菌落计数，计算真菌生长抑制率。结果显示共孵育4小时、8小时、16小时和24小时，台盼蓝染色法测得的菌生长抑制百分率分别为46.8％±8.0％、64.0±5.5％、76.3±7.7％和39.5±4.9％；菌落记数法测得菌生长抑制百分率分别为39.7±4.9％、58.0±8.9％、68.3±7.4％和39.9±5.5％。两种方法间无明显统计学差异。真菌生长抑制率在共孵育早期随孵育时间延长而增高。显示角质形成细胞对红色毛癣菌有直接抑制作用。 然后，在角质形成细胞与红色毛癣菌共孵育的不同时间(4小时、8小时、16小时和24小时)提取角质形成细胞总RNA和膜蛋白，分别采用半定量逆转录PCR和Westernblot方法进行TLR2和TLR4的检测，了解TLR2和TLR4在角质形成细胞抗红色毛癣菌中的作用。结果显示TLR2基因和蛋白表达量随共孵育时间的延长而增加，在共孵育16小时后达到高峰；而TLR4基因和蛋白表达量在共孵育的不同时间无明显差异。采用TLR2和TLR4抗体封闭TLR2和TLR4，再进行角质形成细胞和红色毛癣菌共孵育，对共孵育不同时间(4小时、8小时、16小时和24小时)的菌丝悬液进行台盼蓝染色计数，分别计算阻断TLR2和TLR4后共孵育不同时间红色毛癣菌的生长抑制率变化。结果显示阻断TLR2后红色毛癣菌的生长抑制率明显降低，而阻断TLR4后红色毛癣菌生长抑制率则无明显变化。 提示TLR2作为天然免疫的重要因子，介导角质形成细胞的抗皮肤癣菌作用。而TLR4则不参与角质形成细胞的抗皮肤癣菌作用。 最后，在阻断TLR2和不阻断TLR2情况下，分别在角质形成细胞与红色毛癣菌共孵育的不同时间(4小时、8小时、16小时和24小时)提取角质形成细胞总RNA和核蛋白，采用半定量逆转录PCR和WesternBlot方法进行TLR2信号通路中下游因子MyD88和终末效应分子IL-8及NF-κB在核蛋白中的表达情况，进一步了解角质形成细胞表达的TLR2在抗皮肤癣菌感染中的作用机制。结果显示MyD88和IL-8的核酸表达水平在共孵育早期随共孵育时间的延长而增高，在共孵育16小时达到高峰；阻断TLR2后MyD88的核酸表达水平无明显变化，但IL-8的表达水平则明显下降。核提取物中NF-κB的表达量也随共孵育时间的延长而增高，但在阻断TLR2后其在核提取物中的表达量则明显降低。提示角质形成细胞表达的TLR2可能通过MyD88依赖途径激活NF-κB，导致NF-κB的核转位，进而引起效应分子IL-8的表达增加，产生作用。 结论：角质形成细胞具有直接抑制红色毛癣菌生长的作用；这种作用可通过角质形成细胞表达的TLR2介导，而与TLR4关系不明显。TLR2可能通过MyD88依赖途径激活核因子-κB并使之核转位，促进IL-8的表达，从而发挥作用。本研究为进一步研究皮肤癣菌的天然免疫机制奠定了基础。

目录

前 言

全文摘要

第一部分角质形成细胞与红色毛癣菌共孵育体系中角质形成细胞对红色毛癣菌生长的影响

第二部分角质形成细胞与红色毛癣菌共孵育体系中角质形成细胞表达的Toll样受体对红色毛癣菌生长的影响

第三部分角质形成细胞与红色毛癣菌共孵育体系角质形成细胞表达的Toll样受体通路中下游信号分子、转录因子及终末效应分子的表达

全文小结

论文相关综述：真菌感染中天然免疫若干相关因子研究进展

致谢