G-CSF动员后外周血干细胞培养内皮前体细胞以及治疗糖尿病足的研究

摘要

研究目的：1建立成人外周血来源的单个核细胞体外培养、鉴定内皮前体细胞(EPCs)的方法，以及其在抗原表达方面的生物学特性。 2探讨人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后外周血干细胞对糖尿病足综合征的疗效，对重症高位动脉闭塞下肢血管充盈改善及新增侧枝循环的情况，同时初步评价该方法对下肢周围神经损伤的修复作用。 3探讨自体外周血干细胞移植对糖尿病足患者血浆血管内皮生长因子(VEGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)水平的影响 研究方法：1采用密度梯度离心的方法处理rhG-CSF动员后的单采标本获取外周血单个核细胞(PBMNCs)，在纤维连接素(FN)包备后EGM-2培养基中培养2周，通过免疫表型、活性免疫荧光染色及组织化学染色法鉴定EPCs。 2应用rhG-CSF(600μg/day)动员第5天以CS3000plus血细胞分离机采集干细胞悬液约50ml，配制成1×108/ml的细胞悬液后，注入患病下肢。注射方法为每间隔3×3cm2注射一针，每针注射0.8～1.0ml，注射范围如仅胫前动脉闭塞行双腓肠肌注射，如同时伴股浅动脉闭塞则双腓肠肌及股三、股四头肌同时注射。于注射前及注射后3个月分别评价患者症状体征、外周血管彩色多谱勒血流显像、数字剪影及神经肌肉电生理检测结果。 3应用ELISA法检测患者动员前、动员结束当天、干细胞移植后2个月及正常对照者血浆VEGF及TGF-β1水平。 研究结果：1rhG-CSF动员后应用血细胞分离机采集PBMNCs中含CD45low+CD34+细胞在0.7(0.33～1.0)％，而其中CD133+细胞占CD34+细胞比例中位数8.52(0.89～19.62)％，CD14+细胞比例中位数为19.56(9.61～30.54)％，CD31+细胞占CD14+细胞比例中位数为86.59(71.25～94.41)％。经FN包备后EGM-2培养基体外培养4～6天后有小的细胞集落形成，4～5天左右可见梭形细胞出现，培养2周后鉴定DiI-acLDL、UEA-1-FITC、vWF、VEGF-2(KDR)、CD44，CD105，CD45，CD34及CD14阳性，CD62阴性，具有内皮细胞的形态特点及表型特征。2共13例患者移植后3个月评价结果显示，患者下肢冷感、疼痛及间歇性跛行明显改善。治疗后踝肱比(ABI)明显提高，从治疗前的0.37±0.16提高到治疗后的0.53±0.22，(p=0.002＜0.005)。胫前动脉侧枝数显著增加，治疗前平均侧枝数为0.69±2.02，治疗后侧枝形成数为3.5±2.34，(p=0.001＜0.005)，动脉流速增加，治疗前为7.59±15.26cm/s治疗后为28.94±28.60cm/s，(p=0.002＜0.005)，充盈程度较治疗前明显增加治疗前为0.94±0.97治疗后为1.94±0.83，(p＜0.001)。神经肌肉电生理检测显示，胫运动神经的动作电位潜伏期缩短，胫感觉神经传导速度及波幅均较治疗前明显增加(均p＜0.05)。虽然移植后腓感觉神经的传导速度及波幅也有增加，但无显著性差异。13例患者中10例症状明显好转，3例无明显好转总有效率80％。 3糖尿病足患者rhG-CSF动员前血浆VEGF浓度为180.207±242.067(pg/ml)，TGF-β1浓度为41.730±87.470(pg/ml)，动员后分别为151.378±134.552(pg/ml)及17.453±16.313(pg/ml)，与动员前相比无显著性差别(p=1及p=0.293)。但与正常健康体检老人VEGF浓度为28.395±23.554(pg/ml)及TGF-β1浓度为9.484±6.728(pg/ml)相比，患者动员前VEGF及TGF-β1水平均显著增高(p=0.015＜0.05及p=0.040＜0.05)。移植后2个月血浆VEGF浓度为215.080±183.300(pg/ml)，血浆TGF-β1浓度为20.310±13.224(pg/ml)，与动员前相比亦无显著性差别(p=0.241及p=0.799)。 研究结论：1经rhG-CSF动员后应用血细胞分离机采集PBMNCs中含有较高比例的CD34+及CD14+细胞，应用EGM-2培养基于FN包备过细胞培养皿中体外培养2周后，所获得细胞均具有EPCs特性，这些细胞既有内皮细胞的表型，同时拥有造血细胞的表型，证明经rhG-CSF动员后外周血是PCs有效来源。 2rhG-CSF动员后采集PBMNCs注入既可以改善糖尿病足患者下肢供血，增加闭塞动脉的侧枝循环形成，同时又可以修复下肢神经的损伤，改善患者足部感觉，提高自身保护能力，是治疗糖尿病足的十分有效方法。 3糖尿病下肢动脉闭塞症患者血浆VEGF及TGF-β1水平显著高于正常健康老人。自体外周血干细胞移植及rhG-CSF动员不改变糖尿病下肢动脉闭塞症患者血浆VEGF及TGF-β1水平，不增加血管增殖性病变的风险。

目录

第一部分rhG-CSF动员后外周血干细胞培养内皮前体细胞的研究

第二部分自体外周血干细胞移植治疗重症高位动脉闭塞糖尿病足综合征的初步研究

第三部分自体外周血干细胞移植的对糖尿病下肢动脉闭塞症患者血浆VEGF及TGF-β1水平影响的研究

综 述内皮祖细胞及治疗性血管新生的研究进展

攻读期间发表的文章

致 谢