转录因子NF-E2在β-珠蛋白基因簇表达调控中作用机制的研究

摘要

基因的成簇分布是真核基因在细胞核内分布的一种普遍形式。许多成簇分布的基因以转录后共调控的方式进行调控。基因簇是真核基因成簇分布的方式之一。基因簇的表达通常受共同的调控元件调控。如位点控制区(LCR)、激素应答元件(HRE)等。 真核基因的表达是一个高度复杂的过程，是遗传调控和表观遗传调控综合作用的结果。真核基因的表达调控可以分为三个层次：DNA水平、染色质水平和核水平。DNA水平主要通过DNA与蛋白质以及蛋白质与蛋白质相互作用实现。DNA主要指结构基因以及调节基因转录的顺式作用元件，蛋白质主要指RNA聚合酶以及转录调节蛋白(反式作用因子)。其中远距离调控元件是重要的顺式作用元件，在高等真核生物中广泛存在，对于生物体的分化和发育具有重要的作用。β-珠蛋白基因簇是研究远距离调控元件对于基因簇调控作用机制的良好模型，小鼠β-珠蛋白基因簇包括四个结构基因(Ey，βH1，β-nlajor，和β-minor)，和上游的由一系列核酸酶I高敏位点组成的远距离调控元件LCR。LCR对β-珠蛋白基因簇调控的作用机制长久以来一直是研究珠蛋白基因表达调控的热点。最近，新出现的两项技术RNA-TRAP(Tagging and Recovery of AssociatedProtelns)和3C(Chromosome Conformation Capture，3C)对β-珠蛋白基因簇染色质空间构象的研究结果第一次直接证实了β-珠蛋白基因簇远距离增强元件LCR的成环(looping)作用机制。在此基础上Grosveld等提出，活性染色质中心(Active chromatin hub-ACH)的模型。LCR通过成环机制调控下游基因表达的作用方式被证实以后，成环过程的作用机制立即引起了研究者的极大兴趣。研究集中在顺式作用元件和反式作用因子在成环过程中的作用。GATA-1和EKLF是其中两个重要的参与珠蛋白基因激活的因子。EKLF(erythroid Kruppel-like factor)结合在CACCC保守序列上，主要调控成年期珠蛋白基因的表达(Marini，Asunis et al.2004)。GATA-1广泛分布在整个珠蛋白基因簇LCR区的高敏位点和下游基因的启动子上，在红系分化和珠蛋白基因的表达调控中起重要作用(Im，Grass et al.2005)。在转录因子EKLF敲除的小鼠中，发现ACH结构的形成依赖于转录因子EKLF的结合。同时，在GATA-1缺失的细胞系GlE中对LCR与珠蛋白结构基因空间距离关系的研究也证实了GATA-1参与成环过程。 NF-E2是另一个在红系分化和珠蛋白基因表达调控中起作用的关键因子。NF-E2由大亚基p45和小亚基p18组成，大亚基p45含有反式激活结构域，小亚基p18含有DNA结合结构域。在红系分化过程中，小亚基p18与大亚基p45结合形成NF-E2异源二聚体激活珠蛋白基因的表达。鼠NF-E2异源二聚体的结合位点主要在HS2的AP1/NF-E2序列上。在红系分化过程中，除了LCR区的高敏位点，在β-珠蛋白基因簇的β-maj，β-min的启动子区也有NF-E2的结合。同时，β-maj珠蛋白基因启动子区组蛋白的修饰及RNA聚合酶II(RNAPol II)从LCR向β-maj珠蛋白基因启动子的转移也与NF-E2在该区域的结合有密切关系。 因此，阐明NF-E2在珠蛋白基因表达调控中的作用机理及其在Looping和ACH形成中的作用是一个亟待研究的重要课题。 本研究的目的在于探讨NF-E2在珠蛋白基因表达调控中的作用机制。首先利用逆转录病毒介导的RNA干扰技术在鼠红白血病细胞MEL的亚型DS19细胞系中沉默NF-E2p18小亚基，建立一个NF-E2二聚体功能下降的细胞系。然后运用该细胞克隆。研究NF-E2在成环过程中的作用，探讨该因子与RNAPol II在珠蛋白基因簇上结合的关系。研究发现：当NF-E2p18亚基被沉默后，在β-珠蛋白基因簇的LCR高敏位点HS2，HS3及βmaj的启动子区NF-E2 p18，p45两个亚基的结合均明显下降，表明NF-E2异源二聚体的DNA结合活力下降，该下降直接引起β-珠蛋白基因表达的明显下调。此外，CHIP分析发现：RNA聚合酶II在HS2，HS3及β-maj启动子区的结合下降，这表明RNAPol II在β-珠蛋白基因簇上的结合足NF E2依赖的。运用3C技术，以HS2为引领引物，与含有Ey，βh1，β-maj，β-min基因片段的引物相匹配，对NF-E2在成环过程中的作用机制进行了探讨。结果表明：NF-E2p18的沉默引起β-maj，β-min珠蛋白基因表达下降的同时，表现为HS2与β-maj，β-min之间交联频率的下降，即：空间接近性下降。而HS2与不表达的基因Ey，βH1之间的交联频率无明显变化。Tolhuis等人认为：珠蛋白基因簇在不同的发育阶段，由不同的基因以成环的方式进入到ACH中开始表达，成年期主要为β-maji和β-min珠蛋白基因参与到ACH中，3C结果证实这两个位点与高敏位点HS2间的交联频率提高，而干扰NF-E2p18亚基后，这两个位点与HS2之间的交联频率下降，可见NF-E2可调节LCR中高敏位点与各个基因之间的接近性，上述结果提示：NF-E2是参与成环过程的转录因子之一。 综合NF-E2在细胞核内不同区域的分布对β珠蛋白基因表达激活的影响，NF-E2在β珠蛋白基因簇LCR及结构基因启动子区结合状况及机制的研究，以及我们关于NF-E2参与成环过程的实验结果，我们提出：NF-E2参与珠蛋白基因表达调控的可能机理为：(1).在细胞分化以前，NF-E2p18小亚基与NF-E2p45大亚基分别位于不同的细胞核区域，在一定信号的刺激下，NF-E2 p18小亚基从异染色质区转移到常染色质区，与NF-E2p45大亚基结合，形成有激活功能的NF-E2异源二聚体。(2).NF-E2异源二聚体通过NF-E2/AP1位点结合在LCR区的高敏位点HS2上，同时通过蛋白质与蛋白质相互作用结合到LCR区的其它高敏位点及下游结构基因的启动子上。然后，NF-E2和其它蛋白质因子一起招募RNAPol II，染色质重塑复合物及其它转录起始复合物，分别在LCR与下游基因的启动子上形成不同的蛋白质复合物。(3).转录因子及其它蛋白质复合物的结合引起β珠蛋白基因簇局部区域染色质结构的变化，从而导致成环结构的形成。在成环结构形成的过程巾， RNA I'ol II从LCR被转移到表达基因的肩动子区，激活珠蛋白基因的表达。

目录

论文说明：英文名词及缩写

摘要

前言

1．真核基因的分布及表达调控的特点

1．1真核基因在染色体上成簇分布

1．2转录共调控是成簇基因表达调控的普遍形式

1．3三维构象及核分区是成簇基因表达调控的高级形式

1．4 looping是基因表达激活的一种方式

2．β珠蛋白基因簇是研究成簇基因表达调控的经典模型

2．1鼠β珠蛋白基因簇的结构特点

2．2远距离增强元件LCR的功能特点

2．3远距离增强元件LCR的作用机制

3．转录因子NF-E2在β-珠蛋白基因簇表达调控中具有重要作用

3．1 NF-E2的结构及分布特点

3．2 NF-E2的功能特点

3．3 NF-E2的结合伴随着β珠蛋白基因簇核定位的改变

3．4红系分化过程中NF-E2在β珠蛋白基因簇上的结合模式

4．本研究的主要内容

材料与方法

1．实验材料

1．1本研究中所用合成siRNA的DNA序列

1．2菌株与质粒

1．3细胞系

1．4限制性内切酶及修饰酶

1．5抗体

1．6其它主要试剂

1．7主要仪器设备

2．实验方法

2．1基本技术路线

2．2质粒的构建

2．3细胞培养

2．4病毒包装与转导靶细胞

2．5 DMSO诱导DS19，DS19sip18细胞分化

2．6半定量RT PCR和rcal—time PCR

2．7 Western Blot分析

2．8染色质免疫沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP)

2．9染色质构象定量分析(3C)

实验结果

1．DS19细胞系中NF-E2 p18亚基的沉默

1．1 RNAi干扰靶点的选择

1．2 pBS／U6-sip18载体的构建

1．3 PXRNU6-sip18载体的构建

1．4重组病毒的产生与收集

1．5抗性细胞克隆库的形成

1．6 RT PCR检测抗性细胞库中NF-E2p18的表达

1．7 Western blotting检测DS19sip18细胞中NF-E2p18蛋白的表达

1．8影响逆转录病毒介导的RNA干扰效率的因素

2．鉴定RNA干扰后NF-E2因子体内的功能

2．1 NF-E2p18小亚基干扰后珠蛋白基因表达的变化

2．2 DNA结合能力的变化

3．检测NF-E2因子干扰后珠蛋白基因启动子区RNA Pol II的结合状态

4．染色质构象捕获技术检测NF-E2干扰后珠蛋白基因簇染色质构象的变化

4．1交联染色质复合物酶切效率的鉴定

4．2定量分析的引物的鉴定

4．3 PCR扩增选择适宜模板浓度

4．4以HS2为引领引物检测NF-E2干扰前后珠蛋白基因簇染色质空间构象的变化。

讨论

1．转录因子NF-E2与珠蛋白基因的表达

1．1转录因子NF-E2p18小亚基的沉默影响珠蛋白基因的表达

1．2 β-珠蛋白基因的转录激活与NF-E2在β珠蛋白基因簇上的结合相关

2．NF—E2参与looping的形成

2．1 β-珠蛋白基因簇通过looping的方式激活珠蛋白基因的表达

2．2参与looping形成的重要调控元件及反式作用因子

2．3 NF-E2可能是参与looping形成的转录因子之一

3．转录因子NF—E2的募集与RNA Pol II的结合相关。

4．NF-E2参与β珠蛋白基因转录激活过程的研究

5．NF—E2参与β珠蛋白基因转录激活过程的假说

6．今后的工作展望

小结

参考文献

致献

个人简历