血管内皮生长因子基因转染血管内皮祖细胞治疗肢体缺血

摘要

研究背景和目的：随着人们饮食习惯的改变、生活水平的提高以及寿命的延长，外周动脉疾病的发病率逐年升高，尤其是下肢缺血性疾病已经成为危害人类健康的严重疾病。目前针对下肢缺血性疾病主要手段是药物、外科手术以、腔内治疗等。但是对于远端流出道严重狭窄尤其是合并糖尿病的患者往往没有手术机会，目前还缺乏令人满意的治疗方法。应用各种方法和手段促进新生血管生成，促进缺血肢体侧枝循环的建立，是有效可行的研究方向之一。干细胞治疗和基因治疗是目前治疗缺血性疾病的两大热点。 干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子细胞。一般来说，在干细胞和其终末分化的子代细胞之间存在着被称为“定向祖细胞”的中间祖细胞群，它们具有有限的扩增能力和限制性分化潜能。在体外，干细胞具有自我更新及分化成器官特定的细胞类型的能力，当置于体内，在适当的环境下则能重构器官系统。对干细胞进行定向诱导分化，获取血管内皮祖细胞(EPCs)并以适当的方式移植到体内，则有望在机体的血管新生中发挥重要作用。而VEGF基因的治疗性血管新生作用也已经得到证实。VEGF能增加小血管的通透性、促进内皮细胞增殖和迁移，抑制内皮细胞凋亡，并能刺激内皮细胞产生纤溶酶原激活物，从而有力地促进血管新生。 与成体组织相比，干细胞移植的优势之一即在于其易于改造，可以作为基因治疗良好的靶细胞。因此将干细胞治疗与基因(如VEGF)治疗联系起来治疗缺血性疾病是一种有前途的方法。因此，我们设想利用血管内皮祖细胞作为VEGF基因的载体，同时发挥干细胞及VEGF的促血管新生作用来改善缺血肢体的血供。本实验提取新西兰兔骨髓单个核细胞在体外诱导分化成血管内皮祖细胞，然后体外行VEGF165基因转染，移植到下肢缺血的新西兰兔体内，观测其促进血管新生，改善肢体缺血的效果。为干细胞及基因治疗在缺血性疾病的临床应用提供实验依据。 研究内容和方法1.新西兰兔髂嵴穿刺抽取骨髓，Ficoll离心液梯度离心分离骨髓单个核细胞，然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培养液诱导培养EPCs，探索诱导分化所需要的诱导剂量、接种密度等条件。 2.光镜观察在诱导分化过程中细胞形态的变化，观察是否有内皮细胞的特征性变化。扫描电镜及透射电镜观察所培养细胞的超微结构。应用血管内皮细胞特异性抗体vWF抗体及CD133抗体行间接免疫荧光实验，从不同角度对所培养细胞进行鉴定。 3.用携带VEGF基因的腺病毒质粒转染所培养的细胞，观察不同转染比率对细胞增殖的影响，探索合适的转染比率。 4.以MTT法观察携带VEGF基因的腺病毒质粒转染对于培养细胞增殖能力的影响；双抗体夹心ABC-ELISA法检测上清液中VEGF蛋白的表达情况。 5.制作新西兰兔后肢缺血模型，结扎切断股动脉主干及其主要分支，观察术后实验兔的皮温等体征变化，并行CTA检查检测缺血效果。 6.将后肢缺血的新西兰兔随机分为A、B、C三组，缺血肢体肌肉注射行细胞移植。A组注射EPCs；B组注射VEGF165基因转染后的EPCs；C组注射M199培养基，行下肢CTA检查，观察缺血肢体侧枝循环建立及血供改善情况，并取患肢腓肠肌做石蜡切片，计数新生毛细血管数目。观察移植术后各组新西兰兔皮温及其他症状、体征的变化。 7.部分培养细胞Brdu标记后移植，患肢腓肠肌做冰冻切片应用Brdu抗体行免疫组化实验，观测移植细胞是否整合到缺血局部。 研究结果1.血管内皮祖细胞的诱导分化、培养扩增及鉴定兔骨髓单个核细胞诱导培养48～72h后即可见有细胞贴壁，贴壁细胞逐渐增多，并逐渐变成梭形。培养至8天左右，可观察到数条由梭形贴壁细胞直线生长连接而成的条索，为内皮细胞的特征。7～10天出现多个细胞团，贴壁的梭形细胞开始从细胞团的边缘出芽长出，这种结构类似血岛。培养至14天左右，细胞逐渐融合，连接成大片条索状结构。透射电镜观察细胞内可见细胞核、线粒体、空泡，并可见多个吞饮泡，为内皮细胞特征性结构，细胞边缘可见微绒毛。vWF抗体作一抗，FITC标记二抗，荧光显微镜下可见梭形细胞发出绿色荧光，CD133抗体作一抗，TRITC标记二抗，荧光显微镜下可见梭形细胞发出红色荧光，证实所培养细胞为血管内皮祖细胞。 2.Adv-GFP-VEGF165基因转染EPCs结果转染携带绿色荧光蛋白表达基因的Adv-GFP-VEGF165后24h在荧光显微镜下观察，见几乎所有细胞呈绿色荧光，说明转染成功。增殖实验及细胞形态观察证实1∶50是合适的转染比率。MTT实验观察转染Adv-GFP-VEGF165后EPCs的增殖未受影响。双抗体夹心ABC-ELISA法检测转染VEGF165后的EPCs其上清液中VEGF蛋白浓度明显升高。 3.细胞移植实验结果移植后各组CTA显示EPCs组及VEGF基因转染的EPCs组有较多的侧枝循环建立，均明显好于对照组，而VEGF基因转染的EPCs组又好于EPCs组。免疫组化结果与之相似，各组之间新生毛细血管数目均有显著性差异(P＜0.01)，以VEGF基因转染的EPCs组新生毛细血管数目最多，高于EPCs组，而后者又明显高于对照组。EPCs移植组及VEGF基因转染的EPCs组移植后第14d、28d两个时间点皮温与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，且与对照组相比有较低的组织坏死率，其中VEGF基因转染的EPCs组组织坏死率最低。VEGF基因转染的EPCs组移植后有6例出现一过性肢体水肿。Brdu标记的细胞移植后，患肢腓肠肌冰冻切片免疫组化染色检测到棕褐色细胞，证实移植细胞整合到了缺血局部。 结论1.用VEGF、bFGF、IGF-1诱导培养梯度离心法分离的骨髓单个核细胞，是诱导血管内皮祖细胞的一个简便可行的方法。其中VEGF是诱导的关键性因子，其浓度不应低于20ng/ml。 2.转染比率(细胞：病毒)1∶50是EPCs转染VEGF165基因的合适比率，过高的转染比率会抑制EPCs的增殖，并造成细胞损伤。 3.VEGF165基因转染后，对血管内皮祖细胞的增殖无明显影响。 4.血管内皮祖细胞具有分泌VEGF的能力，而转染VEGF165后的EPCs上清液中VEGF蛋白浓度明显增加。 5.血管内皮祖细胞移植能明显改善后肢缺血新西兰兔的血供，促进血管新生，促进侧枝循环的建立；降低缺血肢体的坏死率。 6.VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量，移植后促血管新生能力增强，较单独EPCs移植具有更大的优越性。 7.利用VEGF基因修饰的EPCs移植治疗肢体缺血性疾病是一个有效可行的方法。

目录

缩略词表

前 言

第一部分兔骨髓来源内皮祖细胞的分离、诱导分化、培养扩增和鉴定

第二部分VEGF基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

第三部分血管内皮祖细胞移植治疗兔后肢缺血的实验研究

综述一 内皮祖细胞与血管再生研究进展

综述二 基因治疗在缺血性疾病中的应用进展

致 谢

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