Rituximab的碘标记方法及Ⅰ-Rituximab治疗荷淋巴瘤裸鼠的实验研究

摘要

放射免疫治疗(RIT)是利用针对肿瘤特异或相关抗原的单克隆抗体携带的放射性核素来实施细胞毒作用的一种肿瘤治疗模式，在此，单抗的主要作用是作为载体，同时本身也能通过促细胞凋亡作用、ADCC、CDC等途径产生细胞毒作用。另外，靶抗原的性质也决定了RIT的有效程度，因此，单抗、靶抗原、放射性核素的选择，对于RIT的疗效至关重要。 Rituximab是以基因工程研制的可变区(V区)为鼠源，其它部分为人源的人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体。CD20抗原表达于肿瘤前B细胞、成熟B细胞，超过90％的B细胞淋巴瘤细胞，而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他造血系细胞，因此CD20抗原是治疗B细胞淋巴瘤选择性药物作用的理想靶点。rituximab可与B淋巴细胞上CD20抗原结合并引发B细胞溶解的免疫反应，与放射性核素联合应用可进一步提高治疗效果。体外研究发现rituximab可使呈药物抵抗性的人体淋巴细胞对一些化疗药物的细胞毒性敏感，并且可导致DHL-4人B淋巴细胞株凋亡。1997年11月，美罗华(rituximab)作为第一种单克隆抗体药物被FDA批准用于临床治疗。 131I、90Y是目前RIT中最常用的两种同位素。前者具有来源广泛，价格低廉，射线易于检测，标记方法简单经典等优点，所以应用较为广泛。另外90Y标记的90Y-Ibritumomabtiuxetan须同时联用111In-Ibritumomabtiuxetan以帮助显像，因而本研究选择131I标记。 目的：1.探讨131I-Rituximab的标记技术，建立一种简单、快速、高效的碘标记Rituximab的方法。分析标记物的稳定性、安全性(无菌、细菌内毒素)；2.通过进行测定131I-Rituximab的免疫活性和了解131I-Rituximab与Raji细胞体外结合情况，制备临床可直接使用的、体内外较稳定、抗体活性损失较小的最终标记物，以易于临床推广应用；3.131I-Rituximab的正常动物体内分布、急性毒性、荷淋巴瘤裸鼠的体内显像实验和治疗实验研究。 方法：1.用NBS法对rituximab进行了125I和131I的标记，用ITLC法测定不同标记时间、不同氧化剂的量、不同抗体的量、不同活度计数的放射性核素、不同的标记温度及不同缓冲液PH值时的标记率。用Se-SephadexG25凝胶柱进行纯化。 2.对Raji细胞的生物学特性进行了研究，用台盼兰染色计数法测细胞活性；用CCK-8试剂盒比色实验法绘制生长曲线，确定对数生长期并计算细胞倍增时间；用流式细胞术测定细胞表面CD20抗原的表达；用MTT法测定标记物的免疫活性；并测定了不同细胞数与不同放射性计数131I-Rituximab的体外结合率及不同储存时间标记物与Raji细胞的体外结合率。 3.正常小鼠静脉注射131I-Rituximab，给药后不同时间点处死动物取血和主要脏器，测放射性计数，了解药物的分布特点。通过显像实验了解131I-Rituximab的靶向性，将荷淋巴瘤裸鼠分为3组：A组不给药，B组只静脉注射131I-Rituximab，C组提前2小时注射Rituximab冷抗体再注射131I-Rituximab，测量裸鼠体重变化和肿瘤体积变化了解治疗效果。 结果：1.反应时间为3分钟，氧化剂与抗体的质量比例为1/30，PH7.0，室温小体积反应为最优条件。用Se-SephadexG25凝胶柱纯化，洗脱曲线为单一峰，紫外吸收峰同放射性结合峰基本相吻合，纯化后标记率能达到95％+。 2.Raji细胞活性大于90％；Raji细胞以5×104/ml的浓度接种细胞，12小时起生长加速，72小时进入平台期，此期间为对数生长期，此后细胞数变化不明显，细胞倍增时间约为24小时；流式细胞术测得Raji细胞表面CD20抗原表达为96％，MTT法证实131I-Rituximab对细胞的生长有抑制作用，其半数抑制量为25μl131I-Rituximab10秒钟放射性计数为3×104，抑制作用与剂量呈正相关。 3.正常小鼠静脉注射131I-Rituximab后体内血液中放射性分布较高，且6天后仍然比较高。预先静脉注射冷抗体2小时后再注射131I-Rituximab，放射性在肿瘤部位的摄取明显高于直接注射131I-Rituximab的组(14.3±2.1&6.3±1.8，P＜0.01)。大部分正常器官的摄取大致相同，肿瘤与正常组织的放射性比值(T/NT)先注射冷抗体组明显高于未提前注射冷抗体组。 4.荷淋巴瘤裸鼠治疗效果可发现：治疗后21天，没有给药组，肿瘤大小与治疗前相比平均增加4倍；直接尾部静脉注射131I-Rituximab组，肿瘤变化不明显；预先静脉注射冷抗体2小时后再注射131I-Rituximab组，肿瘤明显缩小，平均缩小为治疗前的20％。 结论：以上的结果表明本实验所用的标记方法标记率高，标记物稳定性好，体外与Raji细胞结合后能够保持一定的免疫活性，对Raji细胞的生长有抑制作用。131I-Rituximab经动物安全性实验结果证实安全、无毒，对荷淋巴瘤裸鼠的治疗有效。采用预先2小时注射rituximab后再注射131I-Rituximab比直接注射131I-Rituximab肿瘤与正常组织的放射性比值(T/NT)更高，治疗效果更佳。

目录

英文缩略语对照表（Abbreviation Index）

前言

摘 要

第一部分Rituximab的碘标记技术的探讨、分析、稳定性及安全性(无菌、细菌内毒素)

第二部分 131I-Rituximab的免疫活性和体外结合实验

第三部分131I-Rituximab的动物实验

文献综述 非霍奇金淋巴瘤治疗的现状与展望

致 谢