注射重组转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1基因治疗骨关节炎的实验研究

摘要

研究背景骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是中老年人最常见的关节疾患之一，主要表现为关节软骨退变、磨损，骨质增生，导致关节肿胀、疼痛、畸形和功能障碍等，严重影响人们的日常生活。骨关节炎的最基本的病理改变是关节软骨的损伤退变，包括软骨细胞和软骨基质的改变。在骨关节炎的发病机制中，细胞因子占重要的地位。细胞因子可分为保护性细胞因子和破坏性细胞因子，起保护性作用的细胞因子主要有转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)、胰岛素样生长因子(Insuline-likegrowthfactor，IGF)等多肽类生长因子，它们可激活软骨细胞合成软骨基质的能力，对软骨的合成起着至关重要的作用，而且还可通过复杂信号传导机制，抑制IL-1和TNF-α等破坏性因子对关节软骨的破坏作用。这些细胞因子经常联合作用于软骨，维持关节软骨基质的代谢平衡。在骨关节炎病变软骨中，TGF-β和IGF等保护性细胞因子表达明显降低。关节腔内注射保护性细胞因子可修复病损的关节软骨已经为实验所证实。但由于细胞因子代谢半衰期短，直接关节腔内注射需要费用高，剂量不容易调控。通过基因治疗，将保护性细胞因子TGF-β1和IGF-1等基因转入宿主体内，是治疗骨关节炎的一个重要研究方向。 研究目的通过建立骨关节炎动物模型，进行下列观察： 1.观察单基因、多基因体外转染软骨细胞的效果； 2.观察单基因、多基因体内转染对骨关节炎模型的治疗效果； 3.观察转基因后的软骨细胞移植对骨关节炎模型的治疗效果。 研究方法1.关节模型的制作：39只新西兰兔，雌雄不限，体重约3kg，随机分为空白对照、增龄对照、固定3周、固定5周和固定8周共5组，将固定组新西兰兔膝关节予以伸直位石膏固定，处死后观察形态、光镜、电镜、X-ray、MRI和改良Mankin’s评分，检验是否造模成功； 2.获取新西兰兔关节软骨，进行消化、分离，体外培养软骨细胞，并经Ⅱ型胶原免疫组化染色和原位杂交证实为软骨细胞。通过应用rAAV2-TGF-β1、rAAV2-IGF-1的单独转染和联合转染，检测转染后hTGF-β1和hIGF-1在体外培养软骨细胞内的表达情况； 3.通过应用eGFP的示踪作用，比较当前比较流行的两种载体：腺病毒和腺相关病毒对关节软骨体内、体外的转染效果。 4.通过对新西兰兔骨关节炎模型的膝关节腔直接注射rAAV2-TGF-β1、rAAV2-IGF-1的病毒重组体，观察hTGF-β1和hIGF-1在新西兰兔体内的表达情况及对骨关节炎的修复情况； 5.先在体外培养新西兰兔膝关节软骨细胞，应用rAAV2-TGF-β1、rAAV2-IGF-1的病毒重组体进行转染，转染后细胞继续培养扩增，对新西兰兔骨关节炎模型的膝关节注射，观察hTGF-β1和hIGF-1在新西兰兔体内的表达情况及对骨关节炎的修复情况； 结论1.新西兰兔膝关节伸直位石膏固定5周，成功造出骨关节炎模型 2.摸索出了软骨细胞的消化分离、体外培养及基因转染等技术条件，为将来对关节软骨的研究奠定了良好的基础 3.与本元正阳基因股份有限公司合作，成功制作出了rAAV2-TGF-β1、rAAV2-IGF-1病毒重组体，随后的一系列实验也证明了这种病毒重组体的良好质量 4.通过绿色荧光蛋白标记，我们比较了腺病毒与腺相关病毒对关节软骨及软骨细胞的转染效果，得出腺相关病毒对于转染关节软骨和软骨细胞的转染及转染效果为此更为有效 5.通过对动物模型的invivo、exvivo基因治疗，发现多基因联合转染后细胞因子的表达要明显高于单基因转染 6.虽然在invivo基因治疗中TGF-β1出现高表达，但最终对骨关节炎的治疗作用却不理想，相反在exvivo基因治疗中，TGF-β1、IGF-1的表达相对都比较温和，却都收到了良好的治疗效果。这可能与细胞因子的超高表达有关。

目录

缩略词表

前 言

第一部分骨关节炎新西兰兔模型的制作及鉴定

实验二新西兰兔软骨细胞的体外培养及鉴定

实验三eGFP标记比较腺病毒、腺相关病毒体外转染软骨细胞效果

实验四eGFP标记比较腺病毒、腺相关病毒新西兰兔体内转染软骨细胞效果

实验五rAAV2-TGF-β1和rAAV2-IGF-1重组体体外转染软骨细胞的实验研究

实验六同种异体软骨细胞移植实验

实验七rAAV2-TGF-β1和rAAV2-IGF-1重组体基因治疗

论文总结

参考文献

综述 骨关节炎的治疗

综述 关节软骨损伤的治疗

综述 实时荧光定量PCR技术及进展