重组百日咳DNA疫苗实验研究

摘要

本文将第二代疫苗技术和第三代疫苗技术相结合，以基因工程方法研究重组百日咳DNA疫苗的免疫效果。首先，选取百日咳鲍特菌的免疫保护性抗原百日咳毒素S1亚基PTS1、粘着素PRN和丝状血凝素FHA的基因片段。用基因工程的方法，先将PTS1的9位和129位氨基酸进行定点诱变，再将PTS1、PRN、FHA基因片段相连接，得到融合DNA片段PTS1-PRN-FHA(PPF)。将该融合片段重组到真核表达载体pVAX1中，同时将PTS1、PRN、FHA各片段分别重组到真核表达载体pVAX1中。以融合质粒(融合组)和混合的三种质粒(混合组)免疫小鼠，检测发现融合组和混合组均诱导小鼠产生特异性抗体抗PTS1、抗PRN、抗：FHA，并同时产生细胞因子IL-10、IL-4、IFNγ和TNF-α，显示融合质粒与混合质粒一样，能诱导小鼠的体液和细胞免疫反应。本研究应用以下三种方法，探讨改善重组百日咳疫苗免疫效应的策略。一，在初次免疫时合并注射重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF质粒；二，初次免疫时合并注射重组GM-CSF质粒，并以原核表达的重组百日咳抗原片段蛋白进行加强免疫；三，将重组的百日咳抗原片段基因引入腺病毒载体，探讨其免疫效应。 首次将GM-CSF质粒用于重组百日咳DNA疫苗研究。结果显示，与单纯DNA质粒组相比，合并注射GM-CSF质粒的小鼠诱导产生更多的抗PTS1、IL-4和TNF-α，说明在初次免疫的时候合并免疫GM-CSF质粒能增强实验小鼠的细胞和体液免疫反应。在用致死量的百日咳鲍特菌进行脑腔攻击的实验中，单纯DNA质粒组、合并GM-CSF质粒组对致死量脑腔百日咳鲍特菌攻击均有一定的保护作用，但两组的保护率没有显著性差异。 首次提出以GM-CSF质粒合并DNA疫苗进行初次免疫，并以DNA疫苗相应的重组蛋白进行加强免疫的策略。结果显示，与单纯DNA疫苗组比较，初次免疫时无论有无GM-CSF质粒参与，重组蛋白加强免疫的实验组小鼠均诱导产生显著增多的抗PTS1、抗PRN、抗FHA抗体，这说明以重组蛋白加强免疫能够极显著增强．DNA疫苗诱导的体液免疫反应。而与单纯DNA疫苗组相比，合并GM-CSF质粒初次免疫、重组蛋白加强免疫组小鼠诱导产生的抗PTS1、抗PRN、抗FHA、IL-10、IL-4、IFN-γ和TNF-α均显著增多。在特异性脾细胞增殖实验中，GM-CSF质粒初次免疫、重组蛋白加强免疫组小鼠还诱导产生了更强的脾细胞特异性增殖反应。这显示与单纯合并GM-CSF质粒初次免疫以及DNA初次免疫、重组蛋白加强免疫策略相比，合并GM-CSF质粒初次免疫、重组蛋白加强免疫的策略能诱导实验小鼠产生更强的体液和细胞免疫反应，合并细胞因子初次免疫并以重组蛋白进行加强免疫是改善DNA疫苗免疫反应的有效策略，值得进一步的研究和优化。 试图将重组百日咳抗原片段导入腺病毒载体。以病毒作为载体的疫苗有其自身的优越性，可能产生更高的蛋白表达水平，进而诱导更强的免疫反应。试图通过穿梭质粒pShuttleCMV将百日咳抗原片段融合基因重组入腺病毒载体，在AD293细胞组装后感染动物，探讨其诱导的保护性免疫反应。本部分基于腺病毒载体的重组百日咳疫苗正在研究之中。尽管百日咳疫苗已经应用了近一个世纪，但百日咳引起的健康和经济问题并未解决，甚至有更加严重的趋势。DNA疫苗已在多种感染性病原体和多种动物模型中证实能诱导体液和细胞免疫反应，本研究证明DNA疫苗也可能成为应对百日咳的候选疫苗。 DNA疫苗目前存在的问题是在大动物诱导产生的免疫反应强度和对机体的保护作用有限，增强DNA疫苗免疫反应的各种策略是当前研究的热点课题，本研究提出的增强DNA疫苗免疫反应的策略对此作出了有益的尝试。

目录

论文说明：缩略语表

声明

摘要

前言

第一部分重组百日咳DNA疫苗设计、构建及免疫效果评价

第二部分GM-CSF基因对重组百日咳DNA疫苗免疫的作用

第三部分GM-CSF初次免疫、重组蛋白加强免疫策略对重组百日咳DNA疫苗免疫的作用

第四部分基于腺病毒载体的重组百日咳疫苗

全文总结和展望

参考文献

论文综述百日咳与百日咳疫苗

附录

致谢

研究生简历