细胞质内病毒RNA受体RIG-I的表达、蛋白纯化及结晶

摘要

在真核生物体内，除了定位于内吞体膜上的TOLL样受体能够识别入侵机体的病毒RNA，启动机体抗病毒的固有免疫反应外，近年来发现了另一种能够识别病毒RNA的细胞质内受体——RIG-Ⅰ。RIG-Ⅰ能够识别病毒RNA组分，并通过自身的CARD结构域和下游信号分子MAVS的CARD结构域的直接相互作用来传递信号。激活转录因子IRF-3和NF-κB，使其进入细胞核内，诱导干扰素的表达，从而启动固有免疫反应和调节随后的获得性免疫反应，增强机体抵抗病毒的能力。RIG-Ⅰ包含有N端的相串联的两个CARD结构域和C端的一个RNA解旋酶结构域。当没有病毒入侵时，RIG-Ⅰ C末端的解旋酶结构域能够抑制N端CARD结构域的信号传递功能，这一抑制作用可通过RIG-Ⅰ识别入侵病毒的RNA组分而去除。我们认为这一过程是通过RIG-Ⅰ识别入侵病毒的RNA引起自身构象的改变，暴露N端的CARD结构域，来启动信号传递的，但是至今仍没有结构方面的证据来支持这一立论。我们纯化除了大量的适合结晶的RIG-Ⅰ蛋白，并通过共表达的方法证明了RIG-Ⅰ的N端和C端有相互作用，这就对RIG-Ⅰ的分子内部抑制机制提供了生化证据。通过凝胶迁移滞后实验证明RIG-Ⅰ确实可以和化学合成的5’端不含有磷酸基团的双链RNA、体外转录来的5’端含有三磷酸基团的单链或双链直接相互作用。使用elutrap和透析的方法，我们最终获得了不同的RIG-Ⅰ/RNA的复合物。与RIG-Ⅰ单蛋白一样，利用悬吊液滴蒸汽扩散法进行蛋白质结晶后，并没有得到可以进行X-Ray衍射分析的晶体。

目录

文摘

英文文摘

一前言

1免疫系统简介

1.1固有免疫

1.2模式识别受体(TOLL样受体)介导的抗病毒信号转导途径

2 RIG-Ⅰ的研究进展

2.1 RIG-Ⅰ的发现

2.2 RIG-Ⅰ在抗病毒免疫反应中的作用

3原核表达体系

3.1概述

3.2 pET表达系统

4蛋白纯化

4.1亲和纯化(affinity chromatography)

4.2 FPLC纯化

5 蛋白质和核酸的相互作用

6蛋白结晶

7 RIG-Ⅰ的研究意义,内容及技术路线

7.1本研究的技术路线:

7.2具体的研究内容

二材料与方法

1材料

1.1试剂

1.2菌种与质粒

2方法

2.1基因克隆、亚克隆

2.2基因表达和蛋白纯化

2.3体外蛋白质功能的测定

2.4蛋白质晶体

三结果与分析

1重组子的酶切鉴定(图1)

2重组子的测序鉴定

3重组克隆的表达鉴定(图2)

4蛋白可溶性及其行为的分析(图3、4)

5目的蛋白的大量纯化(图5)

6 RNA的体外转录(图6)

7 RIG-ⅠN末端的CARD和C末端的解旋酶结构域的相互作用(图7)

8蛋白质和RNA的相互作用(图8、9、10)

9蛋白质晶体

四结论

五讨论

1克隆构建和外源基因表达的影响因素

1.1克隆构建的影响因素

1.2外源基因表达的影响因素

2蛋白质纯化的影响因素

3不溶性蛋白的处理

4 RNA体外转录以及RNA和蛋白质相互作用的影响因素

5影响蛋白质结晶的因素

参考文献

附录常用的一些缓冲液及试剂的配制

致谢