SIRT1通过上调p27抑制动脉粥样硬化病变中血管平滑肌细胞的增殖

摘要

本文论述了SIRT1通过上调p27<'Kip1>抑制动脉粥样硬化病变中血管平滑肌细胞的增殖。 SIRTl通过上调p27<'Kipl>抑制动脉粥样硬化病变中血管平滑肌细胞的增殖动脉粥样硬化性心脑血管疾病是现代社会严重威胁人类健康的疾病，对于其发病机制的研究是近年来的热点。血管平滑肌细胞的异常增殖是动脉粥样硬化发生与发展的重要致病机理之一，参与了粥样斑块形成的各个阶段。各类危险因素导致内皮功能失常和炎症细胞募集，释放各种细胞因子和生长因子，刺激位于动脉中层的平滑肌发生表型转化并迁移到内膜。活化的平滑肌细胞大量增殖并合成细胞外基质成分，形成纤维帽。随着病变进展，平滑肌细胞凋亡和胞外基质降解使斑块不稳定或破裂形成血栓。在病变晚期，大量平滑肌细胞和成纤维细胞与发生钙化的基质成分共同形成纤维钙化斑块。在动脉粥样硬化发病过程中，氧化应激和血管壁细胞释放的各种生长因子是刺激血管平滑肌细胞增殖的主要原因。 人类的SIRTl(Sirtuin 1)是NAD<'+>依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，在7个SIRT成员中与酵母Sir2(silence information regulator 2)的同源性最高，SIRT基因在各物种之间呈现高度的保守性。近年来的研究发现，SIRT1能够与多种转录因子和转录辅助因子相互作用，包括：MyoD、p300、PGC-1α、PPAR Y、NF-k B、Ku70、p53以及FOXO等，在胚胎发育、组织分化、代谢调节和抵抗应激方面发挥重要的作用。在肿瘤细胞中的研究发现，SIRT1还能够直接调节细胞周期和细胞增殖。在氧化应激时，SIRTl能够与FOXO转录因子相互作用，诱导细胞周期阻滞和抵抗应激。因此认为，在平滑肌细胞中过表达SIRT1可能抑制细胞增殖，从而对动脉粥样硬化起到保护作用。首先，采用H<,2>O<,2>和oxLDL刺激平滑肌细胞，发现平滑肌细胞内源性SIRT1随着氧化应激刺激时间的延长表达上调，而在动物血管损伤模型中，发现血管损伤处平滑肌的SIRT1表达也明显增高，提示SIRT1可能与平滑肌的氧化应激和增殖调控有关。在平滑肌细胞中过表达SIRT1，用<'3>H掺入实验检测细胞增殖，发现SIRT1能够抑制血清刺激诱导的平滑肌细胞增殖，流式细胞仪进行细胞周期分析发现SIRT1引起平滑肌细胞的G1期阻滞。进一步检测SIRT1对于细胞周期调控蛋白表达水平的影响，发现SIRT1不影响周期蛋白的表达，但是能够在血清刺激早期上调p27表达。用SIRT1的抑制剂烟酰胺(Nicotinamide，NAM)处理平滑肌细胞，发现p27随NAM的浓度增加而降低。最后，采用免疫共沉淀的方法证明平滑肌细胞中 SIRT1能够和FOX03a相互作用，推测SIRT1上调p27可能是通过FOX03a介导的。 综合上述结果可以得出结论：SIRT1可以通过增加p27的表达抑制血管平滑肌细胞的增殖。

目录

论文说明:缩写词表

摘要

前言

1动脉粥样硬化性心脑血管疾病严重危害人类健康

2动脉粥样硬化是一个多因素多环节的慢性病理过程

3血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化发生的重要环节

3.1 血管平滑肌细胞增殖参与动脉粥样硬化的各个阶段

3.2 oxLDL能直接诱导VSMC增殖

4人SIRT1功能提示可能具有抑制平滑肌细胞增殖的作用

4.1 SIRT1在肿瘤细胞中影响细胞增殖、参与细胞周期调控

4.2 SIRT1和FOXO相互作用：平衡细胞生存和凋亡

5本研究探讨SIRT1能否抑制血管平滑肌细胞增殖及其分子机制

实验材料

1实验动物

2质粒与腺病毒

3放射性核素

4细胞系

5培养基

6实验试剂与试剂盒

7溶液配置

7.1常用溶液配置

7.2 Western Blot溶液配置

8实验用抗体

9主要仪器设备

实验方法

1.实验流程图

2.细胞培养

2.1细胞传代的操作方法

2.2细胞冻存的操作方法

2.3细胞复苏的操作方法

3.转染细胞

3.1准备细胞

3.2配置转染工作液

3.3细胞后续处理

4.正常大鼠主动脉平滑肌细胞培养

4.1大鼠血管平滑肌(VSMC)原代培养

4.2 VSMC传代培养

5.流式细胞仪检测细胞周期

6.[3H]-TdR DNA合成分析检测

7.提取组织、细胞蛋白

7.1提取组织蛋白

7.2提取细胞蛋白

8.BCA法测定蛋白质浓度

9.Wetern Blot

9.1变性PAGE胶电泳

9.2转膜

9.3免疫反应

9.4显色

10.免疫共沉淀

10.1蛋白样品的准备

10.2去除非特异性结合

10.3免疫沉淀

实验结果

1.平滑肌内源性SIRT1表达

1.1 A7r5细胞经H2O2、oxLDL刺激后SIRT1表达上调

1.2犬血管损伤模型中，SIRT1表达上调

2.SIRT1对平滑肌细胞增殖的影响

2.1 DNA合成分析

2.2 SIRT1对血清刺激时平滑肌细胞细胞周期的影响

3.SIRT1对细胞周期相关蛋白的影响

3.1 SIRT1不影响周期蛋白表达

3.2 SIRT1增加p27表达，降低p21表达

4.Nicotinamide处理平滑肌细胞后p27表达下调

5.大鼠原代血管平滑肌细胞培养

6.原代血管平滑肌细胞过表达SIRT1能够上调p27表达

7.SIRT1在平滑肌细胞中能够与FOXO3a相互作用

讨论

1.SIRT1可能参与调控动脉粥样硬化中平滑肌细胞增殖的线索

2.SIRT1通过引起细胞周期阻滞，抑制平滑肌细胞增殖

3.SIRT1通过调节CKI的表达影响细胞周期进而抑制VSMC增殖

3.1 SIRT1上调p27使平滑肌细胞保持在静息状态

3.2 SIRT1抑制p21表达的作用

3.3 SIRT1可能参与调控p53介导的平滑肌细胞凋亡

4.Nicotinamide能够通过抑制SIRT1活性、降低p27表达

5.SIRT1在平滑肌细胞中能够与FOXO3a相互作用

6.本研究的不足和对未来工作的展望

小结

参考文献

综述 血管平滑肌细胞增殖调控

致谢

个人简历