人IgA/IgM Fc受体：Fcα/μR的表达和功能分析

摘要

Fcα/μR是一种新发现的IgA和IgM的Fc受体。人Fα/μR为单基因家族成员，其基因位于1号染色体lq32区，毗邻其它FcR基因，包括FcγR1a、FcγR2、FcγR3、FcγR1a和pIgR。小鼠的Fcα/μR高亲和力的结合IgM，中等亲和力的结合IgA。人Fcα/μR为Ⅰ型跨膜蛋白，包含有522个氨基酸和3个膜外区结构域。其中Ig样结构域EC2与人、牛和小鼠的pIgR膜外区的第一个结构域有很高的序列同源性，提示这两个受体间可能存在亲缘上和功能上的关系。小鼠的Fcα/μR表达在胸腺、脾、肝、肾、小肠和大肠、睾丸和一些成熟的B细胞和单核细胞上。人的Fcα/μR表达在肾、小肠和二级淋巴器官。 为了确定Fcα/μR在免疫系统中的作用，区分Fcα/μR与pIgR的表达和功能，本研究制备了抗Fcα/μR与pIgR的单克隆抗体。Fcα/μR与pIgR的膜外区分别构建到pET30a质粒中，在E.coli中表达。得到的包涵体蛋白经纯化后免疫Balb/c小鼠并进行细胞融合。产生的单克隆抗体经ELISA、流失细胞分析、Western blott和免疫组化分析鉴定。用确定的特异性抗体进行组织人多组织器官表达分析。 人多组织器官的免疫组化分析结果显示，Fcα/μR表达在肾小管上皮细胞和肾小球系膜区；脾、淋巴结和阑尾淋巴小结中的生发中心；还有散在于消化道粘膜固有层内的浆细胞上。而pIgR则主要集中在小肠、大肠、肺泡和胆囊的上皮细胞上。在其它组织，例如胃底腺、乳腺、睾丸、前列腺和心肌组织，Fcα/μR与pIgR均有不同程度的表达。Fα/μR在脑组织表达阳性。 于pIgR的表达相比，Fcα/μR主要存在于两种组织。其一是位于呼吸、消化和泌尿生殖等通道下层的淋巴组织；另一种是也同时表达pIgR的上皮细胞，如乳腺和肾。然而即使是在这种情况下，这两个受体也会因表达在不同的侧面而执行不同的功能跨膜转运或者吞噬的功能。 IgA肾病(IgAN)是一种最常见的肾小球炎症，同时也是最主要的导致肾功能衰竭的原因。IgAN的发病机制还不清楚。本文用针对Fα/μR的单克隆抗体检测了相关的肾细胞。其中Fcα/μR表达在原代培养的人系膜细胞(HMC)和近曲小管上皮细胞(PTEC)上。在正常人近曲小管细胞系HK—2上，同样检测到了Fcα/μR的蛋白表达。 本实验结果证明，表达在HK—2细胞上的Fcα/μR是一个功能性的IgA受体。用Fcα/μR的中和抗体可以特异性的阻断HK—2细胞与pIgA2和血清IgA的结合，并且阻止HK—2吞噬IgA/IgM免疫复合物。 免疫组化实验证明，Fcα/μR在IgAN病人的肾小球和肾小管内均表达增高。免疫双标实验揭示了IgA沉积和Fcα/μR表达的一致性。IgAN病人的血清IgA与HK—2结合能力增强，并且这种增强可以被抗Fcα/μR的中和抗体所抑制。HK—2和PTEC细胞孵育IgAN病人血清或纯化的血清IgA，可以导致Fcα/μR的明显上调。本实验结果表明，Fcα/μR在IgAN的发病机制中发挥了一定的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：Standard Abbreviations

前言

一、IgA生物学

1、IgA的生物合成与代谢

2、IgA的结构

3、IgA的生物学功能

二、IgA的Fc受体

1、Fcα/μR的分布和表达调控

2、Fcα/μR的基因结构

3、Fcα/μR的蛋白质结构

4、Fcα/μR与IgA、IgM的结合

5、Fcα/μR的信号转导

6、Fcα/μR介导的生理学功能

三、本论文的研究目标

第一部分：抗人Fcα/μR和pIgR单克隆抗体的制备、纯化与鉴定

一、实验材料

1.细胞系

2.菌株、质粒载体和cDNA克隆

3.实验动物

4.主要化学试剂

5.主要抗体

6.工具酶、分子量标准及试剂盒

7.仪器设备

8.溶液配制

二、实验方法

1.分子生物学常规实验操作

2.目的蛋白的原核表达和纯化

3.单克隆抗体的制备、筛选和保藏

4.原核蛋白的复性重折叠

5.Fcα/μR的真核细胞表达

6.蛋白质的标记和交联

7.IgA、IgM、sIgA的分离和纯化

三、实验结果

1.人Fcα/μR膜外区的原核表达

2. 抗-Fcα/μR的单克隆抗体的制备和筛选

3.人Fcα/μR的真核细胞表达

4.人pIgR膜外区的原核表达、复性和抗pIgR的抗体筛选

5.人血清IgA的分离纯化

四、讨论

第二部分：Fcα/μR和pIgR在多种组织器官的表达比较

一、实验材料

1.主要抗体

2.仪器设备

3.主要溶液配制

4.多种正常器官组织芯片

二、实验方法

1.免疫组织化学实验

2.石蜡切片的免疫荧光实验

三、实验结果

1.消化道：胃——小肠——阑尾——结肠——直肠

2.淋巴组织：脾和扁桃体

3.肝胆组织：

4.肺组织：

5.肾组织：

6.乳腺组织：

7.睾丸组织、前列腺组织：

8.脑组织：

9.心肌组织：

10.消化道Fcα/μR阳性细胞的其它抗体染色

四、讨论

1.基于核酸序列的Fcα/μR和pIgR电子表达谱分析

2.基于蛋白序列和单抗的Fcα/μR和pIgR组织表达谱分析

3.基于组织表达谱的Fcα/μR功能初探

第三部分：Fcα/μR在肾细胞上的表达和在IgA肾病中的作用

一、实验材料

1.IgA肾病及对照组病人资料

2.IgA肾病病理组织切片

3.细胞株

4.抗体

二、实验方法

1.HK-2细胞上不同IgA受体的RT-PCR

2.HMC,HMCL，HK-2和PTEC细胞上Fcα/μR的表达分析

3.肾组织的免疫组织化学分析和免疫荧光双标实验

4.HK-2和PTEC细胞结合IgA

5.HK-2细胞吞噬IgA2、IgM和IgG3免疫复合物

6.IgA病人血清或血清IgA细胞孵育实验

7.统计学分析

三、实验结果

1.HK-2细胞上不同IgA受体的RT-PCR

2.HMC，HMCL，HK-2和PTEC细胞上Fcα/μR的表达分析

4.表达在HK-2细胞上的Fcα/μR为功能性IgA受体

5.Fcα/μR和IgA在IgAN组织上的共定位分析

6.IgAN病人的血清IgA可以上调HK-2细胞上的Fcα/μR表达

四、讨论

结语

综述：中性粒细胞上的Fc受体

参考文献

附录

致谢