炭疽芽孢杆菌和霍乱弧菌实时定量PCR快速检测体系的建立及评价

摘要

背景：炭疽是一种多见于在动物间传播的传染性疾病，其传染源为炭疽芽孢杆菌的芽孢。炭疽这个名称来源于希腊语中的煤炭(anthrakis)，因为特异性的黑痂为该疾病的主要特征。17世纪的欧洲曾发生过一次炭疽大流行，导致约6万人丧生。1954年，炭疽毒素(toxin)在炭疽致病中的作用被阐明。2001年，炭疽首次被真正作为生化武器用于恐怖袭击。炭疽可分为三种临床型：皮肤炭疽、肠炭疽、肺炭疽，其中皮肤炭疽可以通过特异性的临床表现(炭样黑色痂皮)和细胞培养进行确诊；而肠炭疽和肺炭疽则因易与其他肠道和肺部疾病混淆而不易诊断，因此，实验室诊断方法成为了有效的辅助诊断方法，如聚合酶链反应(PCR)、血清学检查(PA.based EIASA)以及相关组织的免疫组化检测等。随着检测技术的不断发展，越来越多的检测方法被用于各种细菌的检测中，其中实时定量PCR技术以其快速、通用、高效、全封闭反应等优点越来越受到科研及临床工作者的欢迎，特别是在防止恐怖袭击方面，能够高效快速的检测出炭疽杆菌，对防止生化武器污染极为重要。本研究，我们建立了快速鉴别炭疽芽孢杆菌的单重和多重实时定量PCR体系，并用相关菌种进行了该检测体系的特异性评价，以及用临床模拟粪便标本对该体系开展了临床应用价值的评价。 目的：以炭疽芽孢杆菌的主基因组特异性序列GS和毒素质粒(pXO1)上的致病毒素基因pagA特异性序列为检测靶点，建立高敏感、高特异的荧光单重和双重实时TaqMan聚合酶链反应快速检测体系，并将该体系应用于临床模拟标本的检测，以验证其开展实际临床应用的价值。 方法：根据炭疽杆菌主基因组特异性序列(GS)和特异的毒力岛pagA基因序列(pagA)设计相应的引物和探针，构建含目的基因序列的质粒作为标准模板，利用TaqMan标记探针和Cepheid公司的便携式Smart Cycler Ⅱ进行实时聚合酶链反应，建立炭疽芽孢杆菌基因快速检测体系，评价该检测体系的检测敏感性和特异性，同时用从炭疽灭活疫苗和临床模拟标本中提取的基因组DNA对该体系进行了临床应用价值的评价。 结果：该实时定量PCR检测体系中单基因检测位点检测体系(单重检测体系)在检测炭疽芽孢杆菌质粒标准品时的检测敏感度达101copies/reaction，检测炭疽芽孢杆菌灭活疫苗基因组DNA标本时的检测敏感度达100fg/reaction，检测粪便模拟标本时的检测敏感度达102CFU/reaction：双基因检测位点检测体系(双重检测体系)在检测质粒标准品时的检测敏感度达102copies/reaction，检测疫苗基因组DNA标本时的检测敏感度达1pg/reaction，检测粪便模拟标本时的检测敏感度达102CFU/reaction。该检测体系不论单重还是双重检测体系均达到较高水平的敏感度，该检测体系在检测其他蜡样杆菌群细菌时未出现非特异性扩增，具有较高的特异性。整个实时聚合酶链反应在1h内完成，适合于实验室或野外环境下炭疽芽孢杆菌的快速检测。 结论：本研究建立的单重及双重TaqMan实时聚合酶链反应检测体系可作为炭疽芽孢杆菌快速、准确、特异、敏感的检测手段。有望在临床检验、食品卫生、疾病控制和出入境检疫等领域发挥重要作用。霍乱弧菌

目录

声明

第一部分：炭疽杆菌实时定量PCR快速检测体系的建立及评价

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：霍乱弧菌实时定量PCR快速检测体系的建立及评价

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分：附录

中英文缩略词

文献综述一

文献综述二

致谢