新型紫杉烷类化合物Lx2-32c的抗肿瘤作用及机制研究

摘要

癌症已经成为全球威胁人类健康的首要疾病之一，2007年美国癌症协会统计显示，发达国家癌症紧随心血管疾病位居死亡率第二位，在发展中国家死亡率位居心血管疾病与慢性感染性疾病之后的第三位。统计显示2007年全球新增癌症病例1200多万，2007年总癌症死亡病例大约760万[1]。2007年我国卫生部卫生统计显示，城市、乡镇死亡率排名中癌症同样高举榜首[2]，癌症正在威胁我国广大人民的生命与健康。迄今为止，临床针对癌症患者的治疗除了外科手术治疗、放射治疗外，化疗依然是治疗肿瘤患者最有效的方法[3，4]。 靶向微管动态平衡的抗有丝分裂药物目前在临床多种实体肿瘤治疗中处于重要的地位[5]。按照对微管蛋白的作用方式分为抑制微管聚合的长春碱类、与促进微管聚合的紫杉烷类药物。紫杉醇(Paclitaxel)是第一个用于临床治疗的紫杉烷类药物，它是从红豆杉植物中发现的抗肿瘤天然药物，紫杉醇主要通过与肿瘤细胞微管蛋白β结合[6]，促进微管聚合抑制微管解聚，使肿瘤细胞阻滞于G2/M期，诱发肿瘤细胞凋亡或坏死而达到抗肿瘤的效果[7]。经过漫长的临床前及临床研究后，1992年被美国FDA批准用于治疗复发的和难治的乳腺癌和卵巢癌，以及肺癌和头颈部肿瘤[8]。尽管紫杉醇临床治疗中已获得巨大成功，但临床使用过程中亦发现一些缺点亟需克服。其一是紫杉醇的水溶性差，需要用蓖麻油作为助溶剂，这样就增加了紫杉醇使用时带来的不良反应。其二是易产生严重的耐药现象。主要表现为对某些肿瘤及继发性耐药肿瘤病人的化疗无效[9]。基于上述原因，针对微管为治疗靶点的新型抗肿瘤药物的开发与研究一直都是抗肿瘤药物的研究热点，研究的主要目标是发现能够克服耐药，并具有较好溶解特性和更佳药理活性的新型药物。 植物、微生物以及海洋生物等天然产物一直都是抗肿瘤药物发现的主要来源。分离提取天然产物中有效成分，进行相应的结构修饰是当前抗癌药物研究的热点，同时对现有化合物进行结构修饰也是抗癌药物研究的热点之一。中国医学科学院药物研究所天然药物化学研究室方唯硕研究员课题组通过对三尖杉宁碱(Cephalomarmine)进行结构修饰半合成得到一系列全新紫杉烷类衍生物，其中以代号为Lx2-32c的化合物活性最强[10]。我们已对这类化合物申请了中国化合物专利(申请号200610080890．7)与国际PCT专利(申请号PCT/CN2007/003235)，以便在国际上获得更大范围的保护。 本文对Lx2-32c的体内外抗肿瘤作用及其主要作用机制进行了较深入的探讨，结果如下： 体外研究中，Lx2-32c可抑制多种不同来源肿瘤细胞的生长，如人口腔上皮癌细胞KB及耐药株KB/V、人肺腺癌细胞A549及耐药株A549/Paclitaxel与AT1、人卵巢癌细胞A2780、人宫颈癌细胞Hela、人胃癌细胞BGC-803、BGC-823及MGC-803、人肝癌细胞Bel-7402及耐药株Bel-7402/5-Fu等，MTT法测得其在体外的半数抑制浓度IC50为0.50～10 nmol/L。SRB法测得的GI50为0.13～4.79 nmol/L。Lx2-32c可剂量依赖性地抑制A549、A2780及两株耐药的A549/Paclitaxel细胞的生长，并可显著抑制上述细胞集落形成(P<0.05)。 体内实验表明Lx2-32c能够抑制小鼠Lewis肺癌的生长。Lx2-32c(2.5、5、10mg/kg)对小鼠Lewis肺癌生长的抑制率分别为27.77％、32.46％及76.08％(P<0.01)，呈现较好的剂量效应关系。体内裸鼠异体移植瘤模型中Lx2-32c对三种组织来源的肿瘤都呈现明显的生长抑制活性。其中Lx2-32c(7.5、15、30 mg/kg)对人胃癌BGC-823的生长抑制率分别为30.90％、57.99％和94.44％(P<0.01)；相同剂量对人肺腺癌A549的生长抑制率分别为14.90％、41.70％和63.95％(P<0.05)；同样剂量下对人卵巢癌A2780的抑制率分别为43.55％、42.47％和60.61％(P<0.05)。体内实验中观察到Lx2-32c具有一定的毒性反应。 采用DAPI细胞核染色及流式细胞术等技术观察了Lx2-32c对多种细胞周期的影响。流式细胞术显示，Lx2-32c能够诱导多种组织来源的肿瘤细胞发生G2/M期阻滞，呈现较好的剂量效应关系及时间效应关系。特别对于耐药株A549/Paclitaxel细胞，Lx2-32e仍能够有效地抑制其细胞周期，表现出较强的周期抑制活性。DAPI细胞核染色结果发现，LX2-32c能明显抑制A549细胞及其耐药株的有丝分裂，使细胞停滞在有丝分裂期。同时观察到部分细胞出现核碎裂现象，提示Lx2-32c能够诱导肿瘤细胞凋亡。 利用相对提纯的微管蛋白，采用比浊法及纯化的微管蛋白用荧光探针的方法，探讨了Lx2-32c对微管蛋白动力学的影响。比浊法研究结果表明，Lx2-32c能明显地促进微管蛋白的聚合，同时能够明显地抑制聚合的微管蛋白发生解聚，两者都呈现较好的剂量效应关系。应用DAPI作为荧光探针研究显示Lx2-32c同样能明显地促进微管蛋白的聚合，作用的EC50为2.45 μmol/L，而紫杉醇的EC50为10.26μmol/L，Docetaxel的EC50为2.53 μmol/L。两种实验中都能看到Lx2-32c诱导微管聚合的速率明显强于Docetaxel与Paclitaxel，Lx2-32c的最大作用效应亦强于后两者。 应用微管蛋白间接免疫荧光法及Western Blot法检测细胞微管的原位聚合，以探讨Lx2-32c对细胞内微管动态平衡的影响。免疫荧光实验结果表明，Lx2-32c破坏肿瘤细胞的正常形态，阻碍细胞内纺锤丝的形成，诱导细胞内微管形成微管束，打破细胞的有丝分裂，作用方式与紫杉醇相似。同时对耐紫杉醇的耐药株具有较强的作用。细胞内原位微管聚合实验表明，Lx2-32c能够明显地将细胞内微管的动态平衡由“可溶”态向“不溶”态推进，结果同间接免疫荧光结果类似。说明Lx2-32c打破细胞内微管的正常动态平衡，使微管向着聚合态偏移。 采用Flutax-1作为荧光探针以寻找Lx2-32c在微管蛋白上的结合位点。使用聚合好的微管应用Flutax-1作为探针竞争实验结果发现，Lx2-32c能够与Flutax-1竞争微管蛋白上的结合位点，表明Lx2-32c与Flutax-1具有相同的结合位点，即Lx2-32c的结合位点与Paclitaxel的结合位点相同，同时计算出Lx2-32c与微管蛋白的结合常数(KD)为7.38±0.16×107mol/L。使用Hoechst 33258荧光染色及Western Blot方法分析Lx2-32c对A549细胞凋亡的影响。结果显示Lx2-32c作用24小时后，细胞出现核浓缩、核碎裂等典型的凋亡征象，Western blot分析显示Lx2-32c作用24 h后能够诱导凋亡促进蛋白P53、Bax表达增高。 综上所述，Lx2-32c在体外可广泛抑制不同组织来源的肿瘤细胞的生长；在体内，Lx2-32c能够明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长，同时还能抑制人肺腺癌A549细胞、人胃癌BGC-823及人卵巢癌A2780裸鼠异体移植瘤的生长。Lx2-32c的抗肿瘤作用与促进微管蛋白聚合，抑制微管解聚，抑制细胞内微管动力学平衡，阻滞细胞周期，诱导凋亡相关蛋白P53、Bax表达有关。同时研究发现Lx2-32c在微管蛋白的结合位点与Paclitaxel结合位点相同。

目录

论文说明：英文缩略词

声明

第一部分：新型紫杉烷类化合物Lx2-32c的抗肿瘤作用及机制研究

摘要

前言

实验材料

实验方法

1.细胞培养及形态观察

2.MTT法测定Lx2-32c对肿瘤细胞存活率的影响

3.SRB法测定Lx2-32c对肿瘤细胞的生长抑制作用

4.克隆原形成试验测定Lx2-32c对肿瘤细胞集落形成的影响

5.Lx2-32c对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用

6.Lx2-32c对人体肿瘤细胞裸鼠异体移植瘤的生长抑制作用

7.流式细胞术分析Lx2-32c对肿瘤细胞周期分布的影响

8.循环离心法提取微管蛋白

9.比浊法测定Lx2-32c对微管聚合动力学的影响

10.使用荧光探针测定Lx2-32c对微管蛋白动力学的影响

11.间接免疫荧光法测定Lx2-32c对细胞内微管的影响

12.Western Blot法分析Lx2-32c对细胞内微管蛋白聚合的影响

13.Hoechst 33258染色荧光显微镜观察Lx2-32c对细胞凋亡的影响

14.Western Blot法分析Lx2-32c对细胞内凋亡相关蛋白表达的影响

15.竞争法检测Lx2-32c在微管蛋白的结合位点

实验结果

1.Lx2-32c对人胃癌细胞BGC-823形态的影响

2.Lx2-32c对多种不同组织来源肿瘤细胞的生长抑制作用

3.Lx2-32c对小鼠Lewis肺癌同种移植瘤生长的抑制作用

4.Lx2-32c对裸鼠异体移植瘤的生长抑制作用

5. Lx2-32c对肿瘤细胞周期的影响

6. Lx2-32c对纯化微管蛋白体外动力学的影响

7. Lx2-32c对细胞内微管动力学的影响

8. Lx2-32c对A549细胞凋亡的影响

9.Lx2-32c在微管蛋白结合位点的确定

讨论

结论

参考文献

第二部分：肺腺癌A549/Paclitaxel耐药株的鉴定及其耐药机制研究

摘要

前言

实验材料

实验方法

1.细胞培养及形态观察

2. MTT法测定肿瘤细胞对多种细胞毒类化合物的敏感性

3.克隆原形成试验比较亲本株与耐药株肿瘤细胞的集落形成能力

4.两株细胞生长曲线的比较

5.流式细胞术分析亲代细胞与耐药株细胞的周期分布

6.间接免疫荧光法观察亲本株与耐药株细胞内的微管蛋白

7.RT-PCR法分析药泵基因的表达

8.间接免疫荧光法观察细胞内P-gp的表达

9. Western Blot法分析两株细胞P-gp、p-EGFR及p-AKT蛋白的表达

10. Rhodamine123蓄积试验

11. HPLC测定胞内Paclitaxel的剩余浓度

12.药泵抑制剂Verapamil对A549/Paclitaxel细胞耐药性的逆转作用

实验结果

1.A549/Paclitaxel细胞对多种细胞毒类化合物的多药耐药性

2.A549/Paclitaxel细胞的基本生物学性状

3.A549/Paclitaxel细胞内微管的存在状态

4.A549/Paclitaxel细胞耐药基因及耐药蛋白表达的检测

5. A549/Paclitaxel细胞膜转运蛋白功能的检测

6. Verapamil逆转A549/Paclitaxel细胞的耐药性

7. A549/Paclitaxel细胞内p-EGFR及p-AKT的表达水平增高

讨论

结论

参考文献

论文综述：紫杉烷类化合物研究现状

附录

致谢

个人简历

附件