心肌裂解液体外诱导人羊膜间充质细胞分化过程中离子通道表达的实验研究

摘要

研究背景
　　 心肌细胞损伤后不能再生，以干细胞为基础的细胞治疗有望修复损伤心肌。在心肌梗死后干细胞治疗中细胞来源与评价一直是该领域研究热点。近年来，采用羊膜间充质细胞(Amniotic Membrane-human Mesenchymal Stromal Cells，AM-hMSCs)进行干细胞治疗受到关注，这些看似有应用前景的细胞在体外诱导分化后是否具有心肌细胞的电生理特点仍缺乏研究。
　　 实验目的
　　 1．明确在诱导分化前，AM-hMSCs上表面离子电流的分布特征以及相应离子通道蛋白表达。
　　 2．在心肌裂解液诱导作用下，AM-hMSCs在诱导分化过程中，细胞表面离子通道的变化情况。
　　 实验方法
　　 取羊膜组织，经胶原酶消化，获得AM-hMSCs。根据不同培养条件，将AM-hMSCs分为对照组以及心肌裂解液诱导组。
　　 采用RT-PCR方法检测两组细胞离子通道蛋白mRNA的表达。通过膜片钳技术，记录细胞表面离子电流。比较两组细胞离子电流分布和离子通道蛋白mRNA表达的差异。
　　 实验结果
　　 在诱导分化前的AM-hMSCs中，共可记录到三种外向电流，其中外向延迟整流钾电流(IkDR)占90％，钙激活钾电流(IkCa)占43.3%，瞬时外向电流(Ito)占16.7%。实验中没有记录到内向电流。
　　 经心肌裂解液诱导培养后，AM-hMSCs上Ito电流明显增加（诱导前16.7%与诱导后30.7%，p=0.04），并且有8%的细胞上可以记录到超极化激活的阳离子流（funny current，If)。
　　 对离子通道mRNA的研究显示，在诱导分化前的AM-hMSCs上可以检测到一定水平的MaxIK，Kir2.1，Kvl.4，HminK通道蛋白mRNA的表达。经心肌裂解液诱导分化后，介导If电流的HCN2通道蛋白可表达阳性。
　　 实验结论
　　 本研究首次证实在诱导前的AM-hMSC上存在三种个不同的外向离子通道电流，分别为IkCa，IkDR和Ito，并且可以检测到相应离子通道蛋白mRNA的表达，与记录到的离子流相对应，分别是MaxiK(IkCa)，HminK(IkDR)，kvl.4(Ito)。
　　 经心肌裂解液体外诱导培养，可促使AM-hMSCs分化，表达起搏通道蛋白HCN2，形成If电流，并且增加细胞表面的Ito电流。

目录

缩写词表

研究背景

第一部分:羊膜间充质细胞(AM-hMSCs)表面离子电流特征的研究

1 实验目的

2 实验材料

2.1 实验材料

2.2 主要试剂

2.3 抗体及试剂盒

2.4 主要仪器设备

2.5 主要器械

2.6 主要试剂配制

3 实验方法

3.1 羊膜间充质细胞的分离和培养

3.2 相关实验操作

3.3 羊膜间充质细胞离子通道蛋白mRNA的RT-PCR检测

3.4 羊膜间充质细胞膜片钳实验

3.5 统计学处理

4 实验结果

4.1 细胞表面离子流

4.2 羊膜间充质细胞离子通道蛋白mRNA表达结果

5 讨论

5.1 Ito电流

5.2 Ikca电流

5.3 IkDR电流

5.4 内向电流

5.5 成体间充质干细胞上的离子流

5.5 潜在意义和局限性

6 结论

第二部分:心肌裂解液作用下羊膜间充质细胞离子通道发育变化的研究

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

3.1 羊膜间充质细胞的分离、培养和诱导

3.2 相关实验操作

3.3 心肌转录因子及离子通道蛋白mRNA的RT-PCR检测(同前文)

3.4 细胞膜片钳实验(同前文)

3.5 统计学处理(同前文)

4 实验结果

4.1 不同培养方式下细胞表面的离子流

4.2 心肌裂解液诱导下AM-hMSCs离子通道蛋白及心肌转录因子mRNA表达的结果

4.3 不同实验组western blot检测心肌功能蛋白TnT与离子通道蛋白HCN4的表达结果

5 讨论

5.1 心肌裂解液对间充质细胞的诱导作用

5.2 心肌细胞上离子通道的发育

5.3 干细胞研究中离子通道诱导发育研究的意义

5.4 生物起搏器的研究

6 结论

参考文献

综述

致谢