抗人DR5单抗AD5-10诱导肺癌细胞凋亡敏感性的作用及其分子机制的研究

摘要

AD5—10是一株新的鼠抗人死亡受体5(death receptor 5，DR5)单克隆抗体，为本实验室在前期研究中获得，能够强烈诱导多种肿瘤细胞系发生凋亡，抑制小鼠体内移植瘤的生长，对人正常肝细胞和人外周血淋巴细胞没有明显的诱导毒性，已成为研发生物类药物的候选者，具有抗肿瘤作用的应用前景。但是研究发现，某些肿瘤细胞对AD5—10的诱导却表现为明显的抗性，其抗性是否具有一定的表现规律，其内在的调控机制又是什么，仍然是目前一个有待阐明的科学问题。 本论文拟选用肺癌细胞系A549、SCLC、H460、H1299和Calu—3，分析细胞表面DR5表达水平与细胞对AD5—10诱导凋亡敏感性之间的关系：并进一步寻找凋亡相关调节分子，研究其调节细胞对AD5—10诱导凋亡敏感性的内在分子机制。本研究所选的五株肺癌细胞中，A549和SCLC细胞对AD5—10中度敏感，其他三株细胞对AD5—10不太敏感。研究表明，这五株肺癌细胞对AD5—10的敏感性与细胞中DR5的表达水平无关。但发现，使用AD5—10处理，敏感或中度敏感细胞中，c—FLIPL发生明显的切割，c—FLIPL的表达量显著下降；而不太敏感或抗性的细胞中的c—FLIPL的表达水平没有明显变化。表明c—FLIPL是参与调节AD5—10诱导细胞凋亡的关键分子。 进一步研究证明，c—FLIPL过量表达可以部分抑制人T淋巴细胞白血病细胞SVT35、人肺癌细胞A549对AD5—10的敏感性；而亚毒性浓度的化疗药物环磷酰胺(CHX)、放线菌素D(ActD)能通过下调细胞中c—FLIPL蛋白表达水平，增强AD5—10对肺癌细胞的杀伤活性。此外，通过c—FLIPLsiRNA特异抑制细胞中的c—FLIPL的表达，可以显著增强多种肺癌细胞对AD5—10诱导凋亡的敏感性。其调节机制是c—FLIPLsiRNA和AD5—10能激活细胞中caspase依赖的信号通路，下调Bcl—2家族蛋白Bid和Bcl—XL的表达，进而促进线粒体膜电位的降低以及细胞色素C的释放。并且，研究证明c—FLIPLsiRNA和AD5—10联合作用对正常人细胞没有毒性。 最后，检测了人肺癌组织中c—FLIPL的表达，结果显示c—FLIPL特异高水平表达于人肺癌组织中的肿瘤细胞中，而在正常组织和肿瘤细胞周围间质细胞中表达量很低，两者在统计学上具有显著差异。以上研究提示特异下调c—FLIPL可能是一种非常有潜力的治疗肺癌的策略，特别是针对那些对功能性单抗单独作用产生抗性的肿瘤病人。 第二部分研究中，本文还利用AD5—10可变区基因，构建了表达鼠单链抗体(ScFv)的原核表达载体，并获成功表达。初步证明了它们的肿瘤杀伤活性。同时，将AD5—10的可变区基因和人抗体恒定区基因，分别克隆入表达载体pKN100VL和pG1D105VH，通过筛选获得了稳定表达和分泌人—鼠嵌合抗体(antl—DR5mV—hH)的重组细胞；分泌表达的嵌合抗体与人DR5蛋白具有特异性结合活性，并且能明显杀伤体外培养的人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞，为发展人源化抗体药物的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

第一部分抗人DR5单抗AD5-10诱导肺癌细胞凋亡敏感性的作用及其分子机制的研究

第一节前言

第二节实验结果

1.肺癌细胞对DR5介导凋亡敏感性的比较

2.肺癌细胞中死亡受体以及死亡受体信号通路相关分子的表达

3.肺癌细胞H460中DR5的功能活性鉴定

4.c-FLIPL与AD5-10诱导细胞凋亡敏感性之间的相关性分析

5.AD5-10及TRAIL对H460细胞中c-FLIPLmRNA表达的影响

6.化疗药物CHX、ActD对AD5-10诱导肺癌细胞死亡作用的影响

7.过表达c-FLIPL对AD5-10在敏感或中度敏感细胞中诱导细胞死亡的影响

8.特异抑抑制c-FLIPL的表达对AD5-10在肺癌细胞中凋亡诱导活性的影响

9.c-FLIPL siRNA与AD5-10联合作用对正常细胞没有毒性

10.c-FLIPL在人肺癌组织中的表达

第三节讨论

第四节小结

第二部分抗DR5基因工程抗体的构建及其表达研究

第一节前言

第二节实验结果

第三节讨论

第四节小结

材料与方法

参考文献

综述 c-FLIPL在肿瘤发生机制及肿瘤治疗中的作用

附录 载体图谱

在读期间发表文章及参加会议

致谢