力达霉素辅基蛋白与人体肿瘤组织结合作用的研究以及融合蛋白Fv-LDP免疫活性的研究

摘要

力达霉素(LDM)属于烯二炔类抗肿瘤抗生素，具有强烈的杀伤癌细胞和独特的DNA切割活性。LDM由烯二炔发色团(AE)和辅基蛋白(LDP)两部分组成，两者可拆分和重建。辅基蛋白的主要功能是，对不稳定的、具有杀伤细胞活性的发色团起保护作用。本研究的第一部分利用免疫组织化学方法，结合组织芯片技术，首次发现LDP蛋白具有与人体肿瘤组织特异性结合的能力；本研究的第二部分，对LDP蛋白与肿瘤组织的结合与某些肿瘤治疗靶点的相关性做了进一步的研究；第三部分，对本室利用基因工程技术构建的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv与LDP形成的融合蛋白Fv-LDP的免疫活性进行了研究。 一、力达霉素辅基蛋白与人体肿瘤组织结合作用的研究建立免疫组织化学(IHC)检测方法。采用了两条技术路线：一是将LDP蛋白直接用辣根过氧化物酶标记；二是利用本室已制备的抗LDP的鼠单抗抗体。利用IHC的方法检测LDP蛋白与肿瘤组织的结合。结果表明，两种方法都是可行的，所检测到的LDP蛋白与肿瘤组织的结合部位完全一致。在第二种方法中所设定的空白对照、阴性对照以及吸附实验对照均无着色，证明LDP的免疫染色特异，实验方法可靠。我们采用了第二种方法进行了后续实验的研究。 选用高密度多肿瘤组织芯片研究LDP蛋白与不同肿瘤组织的结合能力，结果表明，在芯片上所包含的17种常见肿瘤中，LDP与膀胱移行细胞癌的结合率最高，达94.4％；与子宫内膜腺癌的结合率最低，为20％。LDP可以与肿瘤组织结合，并且统计学分析表明，此种结合能力在不同的肿瘤组织间存在显著性的差异(X2=64.0，P＜0.001)。 进一步选用乳腺癌、肺癌、结肠癌及其相应正常组织的组织芯片，研究LDP蛋白与肿瘤组织及相应正常组织结合的差异。结果表明，在乳腺癌41例病例中，LDP染色阳性率为73.2％(30/41)，在正常乳腺组织31个组织芯中，LDP染色阳性率为48.3％(15/31)，LDP与乳腺癌及其相应正常组织的结合有显著性差异(X2=4.63，P=0.03)；对肺癌及其相应正常组织的芯片结果分析后可知，在肺癌48例病例中，LDP染色阳性率为83.3％(40/48)，在正常肺组织50个组织芯中，LDP染色阳性率为30.096(15/50)，LDP与肺癌及其相应正常组织的结合有显著性差异(X2=28.3，P＜0.001)；结肠癌及其相应正常组织的组织芯片结果显示，在结肠癌45例组织芯中，LDP染色阳性率为66.7％(36/45)，在正常结肠42个组织芯中，LDP染色阳性率为23.8％(10/42)，结肠癌及其相应正常组织的结合有显著性差异(X2=27，P＜0.001)。LDP蛋白在上述器官中，与肿瘤组织的结合能力与相应正常组织相比，有显著性差异，LDP蛋白可以与肿瘤组织特异性的结合。 利用流式细胞术的方法，检测LDP蛋白与肿瘤细胞的结合。结果表明，辅基蛋白LDP可以与肿瘤细胞结合，其荧光强度明显高于对照组，进一步证明LDP具有与肿瘤细胞特异性结合的能力。 利用激光共聚焦显微镜，观察与肿瘤细胞孵育后的LDP蛋白可与肿瘤细胞结合并被内化，摄入LDP蛋白的肿瘤细胞呈现明显的绿色荧光，同时，也观察到了LDM可引起肿瘤细胞的明显凋亡，细胞核成多核状；而LDP蛋白可被肿瘤细胞内化却不具有此杀伤肿瘤细胞的活性。 二、力达霉素辅基蛋白与肿瘤治疗靶点的相关性研究选用乳腺癌、肺癌、结肠癌的相同的组织芯片，分别进行LDP、VEGF、HER2和EGFR的免疫组织化学染色。 对乳腺癌组织芯片的免疫染色进行分析，结果表明，LDP与乳腺癌的免疫结合与VEGF以及HER2的过表达相关。在90例乳腺癌中，可供VEGF/LDP分析的病例为87例(96.7％)，其中，在54例LDP阳性的病例中，VEGF阳性率为88.9％(48/54)，LDP与乳腺癌的免疫结合能力与VEGF的过表达呈正相关(P＜0.001，r=0.389)；可供HER2/LDP分析的例数为82例(91.1％)，在54例LDP阳性的病例中，HER2的阳性率为84.0％(42/54)，LDP与乳腺癌的免疫结合能力与HER2的过表达呈正相关(P＜0.01，r=0.287)。 对肺癌组织芯片的免疫染色进行分析，结果表明，LDP与肺癌的免疫结合与VEGF以及EGFR的过表达相关。80个组织芯中，可供VEGF/LDP分析的病例为71例(89％)，其中，在40例LDP阳性的病例中，VEGF阳性率为60％(24/40)(P＜0.01，r=0.341)；可供EGFR/LDP分析的病例为73例，在40例LDP阳性的病例中，EGFR的阳性率也为6096(24/40)(P＜0.05，r=0.296)。 对结肠癌组织芯片的免疫染色进行分析，结果表明，LDP与结肠癌的免疫结合与VEGF的过表达相关。80个组织芯中，可供VEGF/LDP分析的病例为62例(78.5％)，在38例LDP阳性的病例中，VEGF的阳性率为76.3％(29/38)(P＜0.05，r=0.271)。 利用流式细胞术的方法，比较融合蛋白SG-LDP和LDP与肺癌细胞NCI-H460的结合能力。结果表明，含有与EGFR受体特异性结合短肽的融合蛋白SG-LDP与肿瘤细胞的结合能力更强。 三、融合蛋白Fy-LDP免疫活性的研究采用ELISA方法、明胶酶谱分析、体外侵袭实验、免疫组化等方法对融合蛋白Fv-LDP的免疫学活性进行分析。间接ELISA结果表明，融合蛋白与Ⅳ型胶原酶、HT-1080细胞、HT-29细胞、PG细胞等均具有免疫反应性。明胶酶谱实验显示，当融合蛋白Fv-LDP浓度达到2mg/ml时，92kDa负染条带消失；当浓度达到4mg/ml时，72kDa负染条带也消失，表明融合蛋白Fv-LDP可有效抑制肿瘤细胞分泌明胶酶；免疫细胞荧光结果显示，肿瘤细胞HT-1080胞浆着绿色荧光，表明融合蛋白Fv-LDP结合于肿瘤细胞的胞浆部位；重组基底膜侵袭实验表明，融合蛋白Fv-LDP可明显抑制肿瘤细胞对人工基底膜的侵袭，并呈剂量依赖性。通过制备兔抗融合蛋白Fv-LDP多克隆抗体，进行融合蛋白Fv-LDP的免疫组织化学检测，结果显示，Fv-LDP可以和肿瘤组织结合，结合部位与其抗体片段所对应的抗原MMP-9类似，也位于肿瘤细胞胞浆内。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语一览表

第一部分力达霉素辅基蛋白与人体肿瘤组织的结合作用研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分力达霉素辅基蛋白与肿瘤治疗靶点的相关性研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分融合蛋白Fv-LDP免疫活性的研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

论文结论

文献综述1 烯二炔类抗肿瘤抗生素辅基蛋白研究进展

文献综述2 以基质金属蛋白酶为靶点的抗肿瘤治疗

致谢