HMG-CoA还原酶抑制剂筛选方法的建立和Atorvastatin改善胰岛素抵抗及其机制研究

摘要

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂-他汀类药物，其临床主要作用是降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，轻度升高高密度脂蛋白胆固醇。同时，他汀类药物还具有许多非降脂作用，如改善血管内皮功能、抑制平滑肌细胞增殖、抑制炎症反应、抗血栓、免疫抑制、抗骨质疏松、防治糖尿病、肾病、老年痴呆及抗病毒等多种作用。由于其具有广泛的药理作用，且副作用低，临床专家推荐年龄在50岁以上人群应每天服用小剂量的他汀类药物，可以大大降低心脑血管病的发生、发展。
　　 为了开发具有我国自主知识产权的他汀类药物，论文第一部分建立了体内快速筛选模型-P-407诱导的金黄地鼠高脂血症模型。实验结果显示，P-407-黄地鼠模型不同于其它高脂血症模型，其特点是:①血脂水平高，与对照相比P<0.01。维持时间长，给予P-407120h后，血清胆固醇含量仍高于对照组。②金黄地鼠脂质代谢水平与人类相似，由于血脂的升高完全是通过改变动物体内合成通路上的酶来实现的，因此适合于他汀类药物的筛选。在论文中利用氟伐他汀异构体考察模型的可靠性，结果显示，其在50mg/kg剂量时可显著降低P-407高脂血症金黄地鼠模型血胆固醇和甘油三酯水平，呈一定量效关系。因此P-407金黄地鼠高脂血症模型完全适合于他汀类药物的快速筛选及药效学评价。
　　 论文第二部分建立了离体筛选方法，用于筛选3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂。克隆编码HMG-CoA还原酶催化结构域，并在大肠杆菌中表达，获得重组HMG-CoA还原酶催化结构域蛋白。根据体内胆固醇合成原理，测定催化反应前后辅酶NADPH的变化量，用以衡量受试化合物的抑制作用。实验中考察了筛选方法的稳定性和可靠性。结果表明，该方法稳定、可靠。Atorvastatin在10-5-10-8M浓度下均有抑制作用，且呈现良好的量效关系。因此该筛选方法可以用来发现新型HMG-CoA还原酶抑制剂。
　　 论文第三部分着重探讨了Atorvastatin与2型糖尿病胰岛素抵抗之间的关系。目前研究表明，肥胖是一种低炎症状态，脂肪组织可以分泌大量的炎症因子包括TNF-α和IL-6等，这些炎症因子可以导致组织对胰岛素不敏感，同时也可以激活炎症通路，进一步加重胰岛素抵抗状态。本论文首先在体外利用报告基因的方法考察Atorvastatin对NF-кB抑制作用，结果显示Atorvastatin能够明显抑制NF-кB的活性，在10-5M时，其抑制作用与地塞米松相当。其次考察了Atorvastatin对TNF-α诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响，结果显示Atorvastatin可以明显增加胰岛素抵抗细胞对胰岛素敏感性。体内研究中，应用了3种肥胖性胰岛素抵抗动物模型研究Atorvastatin的作用。结果表明，Atorvastatin可以改善实验动物的口服葡萄糖糖耐量、胰岛素耐量，降低血清TG、Chol和FFA的含量；提高胰岛素敏感指数(ISI)，降低抵抗指数(HOMA-IR)，可以降低脂肪组织TNF-α、IL-6的含量。在基因水平上的研究发现，药物可以下调TNF-α、IL-6、NF-кB及IKK-β基因在脂肪组织中的表达，同时可以上调IкB基因的表达。蛋白水平研究表明，Atorvastatin可以显著降低NF-кB、IкB在脂肪组织内的表达。
　　 综上所述，本文建立了体内、体外HMG-CoA还原酶抑制剂筛选模型。同时研究了Atorvastatin与2型糖尿病胰岛素抵抗的关系。发现Atorvastatin改善胰岛素抵抗与抑制NF-кB活性，从而抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的产生有关。NF-кB活性的抑制可能是通过三种方式实现的，第一Atorvastatin的直接抑制作用；其二为通过提高IкB蛋白的活性，从而进一步抑制NF-кB的活性；第三通过下调IKK-β基因表达水平，进而减少其蛋白表达水平，间接减少了对IкB蛋白的磷酸化，从而减少了炎症的发生。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分 P-407诱导金黄地鼠高脂血症模型

前言

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

前言

材料与方法

结果

小结

实验原理

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

第三部分 Atorvastatin与胰岛素抵抗的研究

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前言

材料与方法

结果

小结

前言

材料与方法

结果

小结

前言

第三节 Atorvastatin对高脂诱导C57BL/6J小鼠胰岛素抵抗模型的影响

讨论

参考文献

本文的创新点

致谢

个人简历