重组人肿瘤坏死因子α衍生物的制备及聚乙二醇修饰

摘要

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种抗肿瘤细胞因子，对各种肿瘤细胞有直接．细胞毒作用，可激活机体的抗肿瘤免疫反应，引起肿瘤的缺血性坏死，其作为一种潜在的抗肿瘤药物的开发前景引起国内外的广泛重视。目前，其在国内外临床上有广泛的应用，常用于肝癌、宫颈癌的治疗，虽然其抗肿瘤的功能得到了充分的肯定，但是在使用过程中仍具有毒副作用、稳定性差、半衰期短等缺点。 蛋白质PEG修饰技术在过去的近15年中得到了快速发展，已有多篇文献报道，蛋白质药物经PEG修饰后降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期，并用于临床治疗各种疾病。本文拟通过对肿瘤坏死因子-α衍生物的聚乙二醇修饰，获得低毒性、低免疫原性、高稳定性的肿瘤坏死因子-α。 对天然TNF-α结构与功能关系的研究表明，适当改变其结构，可提高其杀伤肿瘤细胞的活性，降低其对组织器官的毒副作用。本研究应用搭桥PCR技术，将肿瘤坏死因子-α基因的前4位氨基酸的编码序列删除，对hTNF-α的第8/9/10/29/31/157位氨基酸的密码子进行定点突变，将突变后的cDNA插入到pBV220载体中构建重组质粒pBV220-tnf-α D4。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选获得了高效表达TNF-α D4突变体的工程菌，表达的重组蛋白约占菌体蛋白总量的45％左右，经硫酸铵沉淀和阳离子交换层析纯化得到纯度达90％以上的重组目蛋白，比活性达到8×107。 在TNF-α的PEG修饰试验中，应用了三种不同分子量的单甲氧基聚乙二醇丁醛(mPEG-丁醛分子量分别为5k、10k、20k)对TNF-α衍生物TNF-α D4进行修饰。通过试验确定了最佳修饰条件，即反应pH6.0，TNF-α D4与mpEG-丁醛(5k)质量比1∶2；TNF-α D4与mPEG-丁醛(10k)质量比1∶4；TNF-α D4与mPEG-丁醛(20k)质量比1∶8，反应时间16h为最佳反应条件。修饰产物经阳离子交换层析纯化得到了较纯的mPEG-TNF-α D4，纯度达85％以上。随后，对TNF-α D4聚乙二醇单一修饰产物的部分性质进行了研究，结果表明TNF-α D4及对其的聚乙二醇修饰达到了预期研究目标。mPEG-TNF-α D4(5k)的比活性达到8.6×107、mPEG-TNF-α D4(10k)比活性达到3.8×107、mPEG-TNF-α D4(20k)比活性达到7.5×106。与TNF-α D4相比，mPEG-TNF-α D4(5k)、mPEG-TNF-α D4(10k)、mPEG-TNF-α D4(20k)的免疫原性降低。此项工作通过应用PEG修饰肿瘤坏死因子-α衍生物，为降低其毒性，增加其活性进行了有益的尝试，为其进一步研究与开发奠定了基础。

目录

声明

摘要

前言

一、实验材料及方法

(一)、实验材料

(二)、实验方法

二、结果与分析

三、讨论

四、小结

参考文献

论文综述：肿瘤坏死因子-α衍生物的研究进展

附录

致谢

作者简历及发表的文章