糖基化对糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病患者高密度脂蛋白胆固醇功能影响的研究

摘要

高密度脂蛋白(HDL)是促进胆固醇逆向转运、抗动脉粥样硬化病变中具有重要的作用的脂蛋白。除血浆水平外，HDL的组成和结构对其抗动脉粥样硬化作用也有重要意义，经物理或化学修饰后的HDL功能发生显著变化，甚至可产生具有致动脉粥样硬化作用的功能异常HDL。2型糖尿病患者常伴脂蛋白代谢异常，动脉粥样硬化发生率高。糖尿病患者血浆中的蛋白质在高糖环境下可发生非酶促糖基化修饰，但目前对糖基化修饰与糖尿病患者HDL功能改变之间的确切关系尚存在较大意见分歧。了解糖尿病患者HDL的糖基化修饰水平及其对HDL结构功能的影响，将有助于进一步了解糖尿病患者动脉粥样硬化性疾病的发病机制，为采取针对性的预防与诊治提供理论依据。本研究获取了糖尿病患者HDI及体外糖基化修饰的健康人HDL组分，比较了不同程度糖基化HDL的抗LDL氧化能力及诱导胆固醇外流功能；旨在明确糖基化修饰与糖尿病HDL抗氧化能力及诱导胆固醇外流功能改变间的关系，并同时考查药物等因素对其的影响。 目的： 建立检测HDL糖基化水平的适宜方法，探索糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病患者HDL的糖基化水平，明确糖基化修饰与糖尿病患者HDL诱导胆固醇外流功能及抗低密度脂蛋白(LDL)氧化保护功能改变之间的关系，探索糖尿病冠心病患者细胞内胆固醇积聚的机制，并考察使用他汀类药物对糖基化修饰及HDL功能的影响。 方法： 1.收集冠心病合并糖尿病患者、单纯冠心病患者血浆样本共19例，健康受试者血浆样本11例； 2.通过密度梯度离心方法分离高密度脂蛋白； 3.健康受试者HDL在体外用不同浓度葡萄糖孵育液进行体外糖基化修饰； 4.分别通过果糖胺法和三硝基苯磺酸(TNBS)法检测患者HDL的糖基化水平和体外修饰的HDL糖基化水平，并评价两种方法；以糖基化结果中位数分为高糖基化水平与低糖基化水平组进行后续功能相关性研究； 5.用放射性同位素方法检测HDL在体外诱导人脐静脉内皮细胞(HUEVC)和HepG2细胞内胆固醇外流的外流率，分析外流率与HDL糖基化水平的相关性； 6.将各组HDL与健康受试者低密度脂蛋白(LDL)共同孵育，加入Cu2+氧化LDL，通过检测紫外吸收OD234nm测定脂质氧化程度，评估HDL抗氧化能力评估，分析HDL的抗氧化能力与HDL糖基化水平的相关性； 7.分析使用他汀类药物对糖尿病患者HDL胆固醇外流功能和抗LDL氧化功能的影响。 结果： 1.本研究中获得的HDL浓度及糖基化水平未达到果糖胺法检测灵敏度范围； 2.经TNBS法检测，糖尿病患者HDL，的糖基化水平高于非糖尿病患者(1.0172对0.8067，p=0.017)，但HDL的糖基化水平与HbA1c(p=0.364)及空腹血糖值(p=0.388)不相关； 3.经体外糖基化修饰的HDL诱导HUEVC和HepG2细胞内胆固醇外流的外流率与糖基化水平均不相关； 4.糖尿病及冠心病患者中，HDL高水平糖基化组与低水平糖基化组的胆固醇外流率间无显著性差异(11.38％对12.09％，p=0.313)： 5.未经他汀类药物治疗的糖尿病患者HDL抗LDL氧化的迟滞时间(Tlag)显著低于非糖尿病患者(95.03min对102.55min，p=0.020)； 6.在全部患者中，HDL的糖基化水平与其抗lDl氧化的Tlag呈负相关性(Pearson相关系数-0.504，p=0.028)，HDl高水平糖基化患者的Tlag也显著低于低糖基化水平组(90.37min对102.46min，p=0.022)； 7.与各组HDl共同孵育的LDl氧化时吸光度最大值(ODmax)间无显著性差异；8.他汀类药物不影响糖尿病患者HDL的糖基化水平(0.9823对1.0730，p=0.395)，但可显著提高患者HDL诱导HUEVC内胆固醇流出的外流率(12.23％对10.28％，p=0.024)，并延长HDI。抗LDL氧化的Tlag(100.68min对95.03min，p=0.020)。 结论： 1)TNBS法可有效检测超速离心法获得的人HDL的糖基化水平。果糖胺法的灵敏度低，不适用于检测超速离心法获得的HDL样品的糖基化水平。2)与非糖尿病患者相比，糖尿病患者HDL的糖基化水平显著升高。糖尿病患者HbA1c值或空腹血糖水平与HDL的糖基化水平不平行。使用他汀类药物不影响糖尿病患者HDL的糖基化水平。 3)糖尿病患者HDL诱导胆固醇外流功能降低，使用他汀类药物可显著改善糖尿病患者HDL的外流功能。但糖基化修饰不是糖尿病患者：HDL外流功能下降的直接原因。 4)糖基化修饰可能是糖尿病患者HDL抗LDL氧化保护能力降低的原因之一。他汀类药物对：HDL抗氧化功能的改善不依赖于其糖基化水平。

目录

论文说明：缩写词表

前言

实验材料

1.实验细胞：

2.主要试剂：

3.主要仪器设备：

4.主要试剂配制：

第一部分HDL体外糖基化修饰后胆固醇外流功能改变的研究

实验方法

1.健康受试者的入选与血浆标本的采集和贮存

2.超速离心法分离脂蛋白

3.HDL体外糖基化修饰

4.检测分离后HDL的糖基化程度并比较不同的糖基化水平检测方法

5.HDL糖基化水平与其诱导胆固醇外流率相关性体外细胞实验研究

实验结果

1.研究对象的入选

2.脂蛋白分离及鉴定结果

3.体外糖基化修饰HDL的糖基化水平

4.细胞的培养与组化染色

5.体外修饰HDL的胆固醇外流率及其与糖基化水平的相关性

第二部分合并冠心病的糖尿病患者HDL胆固醇外流功能及抗UDL氧化功能改变与HDL糖基化水平相关性研究

实验方法

1.研究对象的入选与标本的采集和贮存

2.超速离心法分离脂蛋白

3.检测各组患者HDL的糖基化程度

4.HDL糖基化水平与其诱导胆固醇外流率相关性体外细胞实验研究

5.HDL糖基化水平变化与其抗LDL氧化保护作用的相关性研究

实验结果

1.研究对象的入选及分组

2.不同人群HDL的糖基化水平

3.HDL糖基化水平与胆固醇外流率的相关性

4.HDL糖基化水平变化与其抗LDL氧化保护作用的相关性

讨论

1.方法学讨论

2.实验结果讨论

3.结论

4.展望

参考文献：

综述：高密度脂蛋白的糖基化修饰

致谢