人白细胞介素-23受体（hIL-23R）基因的表达和初步研究

摘要

人白细胞介素-23受体(human Interleukin-23 receptor，hIL-23R))是2002年报道的细胞因子受体，和IL-12Rβ1共同组成IL-23受体复合物，IL-23R蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，与IL-12Rβ2的胞外区域很相似，包含一个N端免疫球蛋白样结构域和两个细胞因子受体功能域。与IL-12Rβ2不同，IL-23R没有邻近膜的三个纤维蛋白原Ⅲ型功能域。在hIL-23R上有7个潜在的N-糖基化位点，其胞膜近侧区有类似于细胞因子受体特征性WSXWS模序的WQPWS，IL-23R复合物中的IL-12Rβ1能识别IL-23的IL-23p40亚单位并与之结合，由IL-23R介导细胞内的信号转导。 由于IL-23及其受体与IL-12及其受体在结构上的相似性，所以人们对于IL-23及其受体的功能研究很多是基于对IL-12及其受体的研究进行的。国外已有研究证明IL-23在抗肿瘤方面有一定的作用，而且IL-12Rβ2基因在慢性B细胞恶性肿瘤中作为肿瘤抑制因子，但目前关于IL-23R和肿瘤的相关性尚未有报道。我们前期研究发现了在一些肿瘤细胞有IL-23R剪接异构体的表达，但目前对于hIL-23R的功能研究尚处于初始阶段，对于hIL-23R的功能研究很多正在进行中。 本课题包括的研究内容有：1)首先从外周血单个核细胞(PBMC)中利用一对特异性引物克隆得到人白细胞介素23受体(hIL-23R)基因，分别构建真核表达载体pCMV-Myc-hIL-23R和原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R。2)真核表达hIL-23R蛋白，并研究其细胞定位及对细胞周期和细胞凋亡的影响。3)原核诱导GST-hIL-23R融合蛋白表达。4)用基因工程方法分别构建hIL-23R胞外区、胞内区的原核表达载体，诱导带有GST标签的hIL-23R蛋白分段表达，为进一步研究hIL-23R的功能做准备。 第一阶段为克隆hIL-23R基因，从外周血单个核细胞中克隆得到1890bp的hIL-23R基因，连接于pMD-19-T载体，用测序正确的pMD-19-T-hiL-23R做模板以PCR方法扩增hIL-23R，分别构建真核表达载体pCMV-Myc-hIL-23R和原核表达载体pGEX-4T-1-hiL-23R。 在第二阶段的工作中，通过将pCMV-Myc-hIL-23R转染HEK 293T细胞，用RT-PCR和Western-blot方法检测到其成功表达，用免疫荧光染色对hIL-23R蛋白在HEK 293T细胞和COS-7细胞中进行细胞定位；并通过流式细胞术检测了hIL-23R蛋白对细胞周期和细胞凋亡的影响。 在第三阶段的工作中，通过将pGEX-4T-1-hIL-23R转化大肠杆菌BL21(DE3)，成功地诱导了带有GST标签的hIL-23R重组蛋白。发现该蛋白以包涵体形式存在，并用Western-blot验证了GST融合蛋白的表达，为得到hIL-23R蛋白抗体做了准备； 在第四阶段的工作中，在大肠杆菌中成功地诱导了带有GST标签的hIL-23R重组蛋白的胞内区和胞外区，改变诱导条件(低温诱导)后胞内区蛋白有可溶性表达，而胞外区蛋白仍为包涵体表达，为hIL-23R蛋白的纯化和制备针对hIL-23R胞内区的抗体做准备，利用其抗体可以研究hIL-23R与肿瘤的发生的相关性。 结论：我们从外周血单个核细胞中克隆得到了hIL-23R的编码区，分别构建了原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R和真核表达载体pCMV-Myc-hIL-23R。并分别在大肠杆菌和HEK 293T细胞中表达了hIL-23R蛋白；通过将hIL-23R转染HEK 293T细胞，研究了hIL-23R蛋白表达对细胞周期和细胞凋亡的影响；通过对hIL-23R的分段表达，得到了可溶性表达的hIL-23R胞内区蛋白；成功搭建了为进一步研究全长hIL-23R功能的多种平台。 本研究为hIL-23R的功能研究及其与肿瘤的相关性研究提供了依据，但其参与抗肿瘤的机制及能否应用于临床研究，还需要进一步探讨。

目录

论文说明:中英文缩略语

前 言

实验材料

实验方法

第一部分hIL-23R基因的克隆和表达载体的构建

第二部分重组质粒pCMV-Myc-hlL-23R的真核表达和功能研究

第三部分重组质粒pGEX-4T-1-hiL-23R的原核表达及鉴定

第四部分hIL-23R蛋白胞内区、胞外区的分段表达

实验结果

实验讨论

小 结

白细胞介素-23及其受体肿瘤的相关性研究进展

致 谢

附 录