血清脂蛋白胆固醇准确测定方法研究

摘要

准确测定血清脂蛋白胆固醇需首先分离各种脂蛋白。超速离心法是各种脂蛋白的定义方法，同时也是最可靠的脂蛋白分离方法。用超速离心法可以将各种脂蛋白和亚类大致分为高密度脂蛋白(HDL，密度1.063-1.12g/mL)、HDL2(1.063-1.125)、HDL3(1.125-1.21)、低密度脂蛋白(LDL，1.006-1.063)、小而密LDL(LDLb，1.044-1.063)、大而轻LDL(LDLa，1.006-1.044)、中间密度脂蛋白(IDL，1.006-1.019)、和一种特殊的脂蛋白(a)[Lp(a)，(1.05-1.11)]。在目前的临床检验领域，IDL和Lp(a)包括在LDL中。由于Lp(a)在HDL和LDL中均有分布，所以用超速离心分离各种脂蛋白及亚类必须首先消除Lp(a)的影响。 Lp(a)由一分子类似于LDL的脂蛋白颗粒和载脂蛋白(apo)(a)组成，apo(a)与LDL颗粒中的apoB以二硫键相连接，少量Lp(a)还与其他脂蛋白(主要为含apoB的β-脂蛋白)以非共价键结合。本研究选择用β-巯基乙醇(ME)解离Lp(a)，对ME的浓度、ME解离Lp(a)的有效性、Lp(a)解离对HDL稳定性的影响、脯氨酸的作用等进行试验，发现0.05mol/LME可以使Lp(a)解离为不含apo(a)的Lp(a)[Lp(a-)]和apo(a)，0.1mol/L脯氨酸可有效消除Lp(a)与其他脂蛋白之间的非共价键结合；解离后的Lp(a-)与LDL密度相近，从而实现HDL的超速离心分离及HDL和LDL包括IDL和Lp(a)]的测定。进一步的研究发现，解离后Lp(a-)的密度<1.040，与解离前(1.05-1.11)存在明显的密度分界区域，LDLa和LDLb的密度分界点1.044恰好在此区域，这一特点不仅使超速离心分离测定Lp(a)成为可能，而且还可以分离测定LDLa和LDLb。 各种脂蛋白及其亚类胆固醇测定需要精密的胆固醇分析方法。本试验选用市售豆甾醇作内标，用Jones反应氧化胆固醇和内标为胆甾/豆甾-4-烯-3,6-二酮，以提高胆固醇和内标的可分离性及检测灵敏度。所建方法易操作，灵敏度、精密度好，适用于超速离心后脂蛋白组分中低水平胆固醇测定。 超速离心高效液相色谱(HPLC)准确测定血清脂蛋白胆固醇的方法如下：血清与含脯氨酸的溴化钠溶液混合，使背景密度为1.006，超速离心分离底部组分(BF)HDL和LDL (BF1.006)；使背景密度为1.044，超速离心分离LDLb、Lp(a)和HDL(BF1.044)。血清与含ME和脯氨酸的溴化钠溶液混合，使背景密度为1.044，超速离心分离LDLb和HDL(BF1.044ME)：背景密度为1.063，超速离心分离HDL(BF1.063ME)使背景密度为1.125，超速离心分离HDL3(BF1.125ME)。不同密度和条件超速离心后的底部组分胆固醇(BFC)测定用HPLC法，计算各脂蛋白组分胆固醇。 HDLC=BF1.063MECLDLC=BF1.006C-BF1.063MECLDLaC=BF1.006C-BF1.044CLDLbC=BF1.044MEC-BF1.063MECHDL2C=BF1.063MEC-BF1.125MECHDL3C=BF1.125MECLp(a)-C=BF1.044C-BF1.044MEC超速离心HPLC法测定血清超速离心底部组分胆固醇(HDLC+LDLC)的结果与美国疾病控制与预防中心(CDC)的β-定量法高度相关(r=0.998)；测定HDLC结果与CDC指定比对方法(DCM)高度相关(r=0.998)。本法测定HDLC和LDLC的总CV分别为0.96％~2.07％和0.65％-1.12％；测定HDL2C、HDL3C、LDLaC和LDLbC的总CV分别为0.85-2.66％，0.87-3.21％，0.86-1.11％，和2.59-6.35％。Lp(a)-C测定的总CV为4.42-12.29％。 为了降低Lp(a)-C的测定误差，提高灵敏度，设计了两次超速离心直接分离和测定Lp(a)-C的方法。血清溶液在脯氨酸存在下1.044的背景密度超速离心，>95％的Lp(a)分布在离心管的底部；用含ME的密度液将BF调节密度至1.040，再次超速离心，则解离后的Lp(a-)分布在顶部组分，HPLC测定顶部组分胆固醇即为Lp(a)-C。两次超速离心的方法提高了Lp(a)-C测定的灵敏度和特异性，测定Lp(a)-C的总CV为2.85-4.29％。 综上所述，本研究通过研究Lp(a)的解离和解离前后的密度分布建立了血清主要脂蛋白及其亚类胆固醇的测定方法。本方法有以下特点：(1)首次用超速离心分离包括脂蛋白亚类和Lp(a)在内的多种脂蛋白组分，所分离的脂蛋白与应用最广泛的脂蛋白定义一致；(2)物理方法分离脂蛋白，样品处理过程中的脂蛋白胆固醇变化减至最低程度；(3)统一用胆固醇代表各脂蛋白水平，可使各脂蛋白[包括Lp(a)]和亚类进行直接对比；(4)所需样品量小，0.5mL血清可以测定7项主要脂蛋白组分，一次最多可分析20个样品；(5)样品制备简单、方法易操作，精密度良好。本方法具有良好的准确性和实用性，有望作为HDL、LDL及其亚类胆固醇和Lp(a)-C测定的参考方法。

目录

论文说明：缩略语表

引言

脂蛋白分离和测定条件研究

1材料与方法

1.1试剂

1.2样品

1.3仪器

1.4密度溶液的配制

1.5 DCM测定血清HDLC

1.6血清TC、TG和Lp(a)质量测定

2研究过程和结果

2.1HDL的超速离心分离

2.2 Lp(a)分离测定研究

2.3 HDL和LDL亚类的分离

2.4样品制备条件的选择和内标的应用

2.5 HPC测定脂蛋白胆固醇方法的优化

血清高密度和低密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白亚类和脂蛋白(a)胆固醇测定方法的建立和方法学评价

1原理

2仪器

3试剂

4超速离心密度液配制

5标准溶液和内标溶液配制

6样品制备和超速离心

7高效液相色谱测定脂蛋白组分胆固醇

8其他分析

9统计分析

10注意事项

11精密度实验

12超速离心HPLC法和β-定量法测定血清超速离心底部组分胆固醇结果对比

13超速离心高效液相色谱法与DCM测定HDLC结果比较

Lp(a)-C准确测定--两步超速离心方法的建立和方法学评价

1原理

2密度溶液配制

3标准溶液和内标溶液配制

4两步超速离心测定Lp(a)-C样品制备

5注意事项

6方法的精密度试验

7两步超速离心法与一次超速离心测定Lp(a)-c方法对比

8两步超速离心法测定Lp(a).C与免疫比浊法测定Lp(a)质量的比较

9 Lp(a)-C检测灵敏度

健康志愿者血清脂蛋白胆固醇分析

1 健康志愿者血清脂蛋白胆固醇测定

2 HDL亚类分布、参考值及与传统血脂指标的关系

3 LDL亚类分布、参考值及与传统血脂指标的关系

4 Lp(a)-C分布、参考值及与传统血脂指标的关系

讨 论

参考文献

综述1：血清脂蛋白胆固醇测定及其标准化

综述2： 血浆脂蛋白(a)测定研究进展

附录：博士在读期间发表文章

致 谢