人呼吸道合胞病毒(HRSV)低温传代株稳定性的研究

摘要

本研究课题目的是分析HRSV A2株经低温培养传代后毒力改变的情况及稳定性检测，为疫苗的开发做基础研究。实验内容主要包括：HRSV在KMB17上于32℃连续传代、低温传代株遗传稳定性检测、在不同温度及物理条件下HRSV稳定性的观察及核酸荧光染色法观察HRSV合胞现象。 HRSV在KMB17上于32℃连续传代已至35代，病毒培养增殖时间在7—10天左右，感染性滴度在7.0-7.5 lgCCID50/ml之间，表明HRSV已慢慢适应KMB17细胞，为培养细胞基质的更换(使用二倍体细胞培养病毒)及减毒株的筛选奠定良好基础。 遗传稳定性观察包括：一步生长曲线、免疫原性及核酸序列检测。本实验对低温培养的第5、19、28和34代做了一步生长曲线观察，结果表明HRSV在低温下的适应性，即低温传代代次较高的病毒在32℃病变时间越来越短，感染性滴度也越来越高，至34、35代时感染性滴度已稳定在7.5lgCCID50/ml。另外，实验选择经低温培养的第21和26代病毒进行动物实验，检测其免疫原性。结果显示，低温传代的HRSV减毒程度还不够，仍能致靶器官组织产生明显炎症及间质性肺炎；且抗原性不强，诱导机体产生的中和抗体效价约为1：2—1：8。最后实验对低温培养的不同代次病毒进行了G蛋白基因核酸序列测定，通过对低温传代株P15、P20、P25的序列比对，未发现编码G蛋白基因发生变异。 HRSV在不同温度保存及物理条件处理后稳定性观察，结果显示HRSV稳定性较差，在37℃和室温下保存都不稳定，感染性滴度每天分别下降1.0-2.0 lgCCID50/ml和0.2-0.8 lgCCID50/ml；在4℃下感染性滴度下降较慢，存放5周之后，病毒滴度变化<0.6 lgCCID50/ml，可短暂保存；—20℃保存3个月后滴度仅下降0.5 lgCCID50/ml，为保证感染性滴度稳定HRSV需保存于—20℃或更低温度。HRSV在冻融之后，病毒感染性滴度呈明显下降趋势，每冻融1次，病毒感染性滴度下降约1.30 lgCCID50/ml。经超声波处理后，HRSV病毒感染性滴度下降更快，超声处理2次后，病毒几乎无感染性。 鉴于HRSV稳定性差，实验在病毒液中加入保护剂后观察了滴度下降的情况。结果显示，保护剂对病毒热不稳定性和冻融不稳定性均起到稳定作用。 核酸荧光染色法观察HRSV在几种细胞上的合胞体现象。其中Hep—2细胞是HRSV病变最快的细胞，在培养24h后，可看见合胞现象；Vero细胞病变时间次之，KMB17细胞最慢，且病变形态不同于前两者。可能与病毒对细胞的敏感程度及细胞表面受体类型不同有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

实验材料和方法

结果与分析

讨论

小结

参考文献

论文综述 RSV感染后宿主反应及分子病理机制

附录 英文缩写

致谢

个人简历