TSC2基因在急性白血病中的异常表达caspase-8异构体的克隆及其在细胞凋亡中的作用

摘要

第一部分
　　 研究目的：TSC(Tuberous sclerosis complex，TSC)基因TSC1和TSC2分别编码蛋白hamartin和tuberin。研究表明TSC1和TSC2形成异源二聚复合体参与mTOR(themammalian Target of Rapamycin)信号途径，其作为抑癌基因在细胞增殖、细胞黏附等方面起重要的作用。本文检测了TSC基因在急性白血病(acuteleukemia，AL)细胞中的表达及其临床意义，并探讨其异常表达的可能机制。
　　 研究方法：应用实时定量逆转录PCR(QuantitativeReal-time Reverse Transcription PCR)，对104例AL患者，29例正常人骨髓标本进行TSC基因转录本的检测。免疫印迹(Western Blot Analysis)检测tuberin蛋白在急性白血病中的表达。采用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)检测急性白血病患者和Nalm-6、Jurkat、U937和HL-60白血病细胞系中TSC2基因启动子区的甲基化状态。半定量RT-PCR(Reverse Transcription PCR)检测5-Aza(5-Aza-2’-deoxycytidine)处理Nalm-6和U937细胞后，TSC2基因mRNA表达变化。瑞氏染色及流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测5-Aza对细胞凋亡的影响。
　　 结果:1)与正常对照相比，初治ALTSC2基因mRNA表达水平明显降低，其表达中位数分别是19.818(6.319-63.313)和84.746(45.508-278.000)，(p<0.001)。2)白血病不同亚型中TSC2基因mRNA的表达:在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、双表型急性白血病(biphenotypic acute leukaenua，BAL)中，TSC2转录体的表达水平与正常对照相比均有明显降低，三者之间无明显差异。在AMLFAB分型中，TSC2基因的表达分布不平衡，其中M3，M5，M6与正常对照相比，表达明显降低，而M2，M4则无明显差异。3)TSC2mRNA表达水平与临床指标的相关性:将AL患者按年龄分组发现>＝60岁组表达明显低于<60岁组，其表达中位数分别是7.906(0.318-33.911)和22.105(8.273-72.915)，但是TSC2的表达与患者的性别，外周血WBC计数，骨髓原始细胞数、CD34阳性率、及细胞遗传学预后分组无明显相关性。在细胞遗传学预后分组中，预后良好和预后中等组中TSC2表达水平均高于预后不良组，其表达中位数分别是17.729(5.458-93.303)、22.105(2.571-80.356)和6.525(0.380-9.788)。4)MSP结果显示，在10例急性白血病患者骨髓单个核细胞中，9例存在TSC2启动子区过度甲基化，而在2例正常对照标本中未检测到TSC2启动子区域的甲基化，细胞系检测结果显示HL60、Jurkat细胞显示甲基化和非甲基化共存，Nalm-6显示甲基化占优势，而U937细胞显示非甲基化占优势。5)经不同浓度去甲基化药物5-Aza处理后，Nalm-6细胞TSC2mRNA表达水平逐渐升高，而U937细胞TSC2mRNA表达水平无明显改变。6)应用去甲基化药物5-Aza(1.6μM)作用于Nalm-6和U937细胞72小时后，细胞形态学呈典型凋亡改变，细胞膜起泡、染色质浓集。流式细胞术AnnexinV/PI双染结果显示，Nalm-6和U937凋亡细胞比例较未处理组均明显增加(p<0.01)。
　　 结论:急性白血病患者中，TSC2基因表达下调。基因启动子区过度甲基化可能是其表达异常的重要机制。
　　 第二部分
　　 研究目的:人类caspase-8(FLICE/MACH/Mch5)基因编码白介素-1β转化酶(interleukin-1 β converting enzyme，ICE)相关半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡途径中关键的启动酶。Caspases-8蛋白由prodomain和caspase domain组成，prodomain包含两个DED(death effect domain)区。本研究克隆了一个新的caspase-8截短型异构体caspase-8s，并探讨其在细胞凋亡中的作用。
　　 研究方法:应用逆转录PCR(RT-PCR)及测序检测caspase-8s转录体在人类急性白血病和正常人骨髓单个核细胞中的表达；检测caspase-8s转录体在细胞系293T、Jurkat、MCF-7、U937、K562、HL60、Nalm-6、NB4及KG-1中的表达；Western blot进一步证实caspase-8s蛋白在急性白血病骨髓单个核细胞中的表达。构建表达载体pcDNA3.1-caspase-8-DED2、pcDNA3.1-caspase-8s-DED2和pcDNA3.O-FADD，通过磷酸钙转染方法瞬时转染293T细胞，Western Blot及免疫共沉淀实验分别检测caspase-8-DED2，caspase-8s-DED2与FADD蛋白的相互作用。构建含caspase-8s全长CDS(coding sequence)区的慢病毒表达载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-caspase-8s，稳定转染Jurkat细胞:梯状DNA凝胶电泳及AnnexinV-PE/7-AAD染色法检测Fas抗体诱导的细胞凋亡；MTT检测Fas抗体对细胞的生长抑制状况。
　　 结果:1)RT-PCR检测到一新的caspase-8异构体，经测序及序列比对发现与基因库caspase-8 cDNA序列(GenBank序列号:NM033355)相比，存在106bp的碱基缺失。分析该突变体基因序列发现由于缺失导致翻译提前终止，编码108aa的蛋白质，与caspase-8蛋白结构比较(GenBank序列号:AAD24962)，含DED1和部分DED2结构域。进一步检测正常人骨髓单个核细胞也发现部分标本存在该异构体的表达。2)RT-PCR结果显示，在293T、Jurkat、MCF-7、U937、K562、HL60、Nalm-6、NB4及KG-1细胞系中，caspase-8s转录体的表达存在明显差异。3)Western blot分析发现在部分白血病骨髓单个核细胞中存在caspase-8s蛋白水平的表达。4)免疫共沉淀实验表明，caspase-8s-DED2与caspase-8-DED2均可在真核细胞内与FADD形成免疫复合物。5)成功构建pCDH1-MCS1-EF1-caspase-8s-cop GFP慢病毒表达载体，稳定转染Jurkat细胞并由Western blot鉴定稳定克隆。6)在不同剂量(0 ng/ml、50ng/ml、75ng/ml) FAS抗体诱导下，感染caspase-8s组(JS2，JS3克隆)细胞凋亡率明显高于野生型Jurkat细胞组和空载体组，差异具有统计学意义(p<0.05)。7)在50ng/ml FAS抗体诱导下，感染caspase-8s组(JS2克隆)可观察到明显的梯状DNA条带，而野生型Jurkat细胞组和空载体组(JP4克隆)未观察到梯状DNA条带。8)在不同剂量FAS抗体诱导下，感染caspase-8s组(JS2克隆)细胞增殖抑制率明显高于野生型Jurkat细胞组和空载体组，差异具有统计学意义(p<0.05)，且具有FAS抗体的浓度依赖性。
　　 结论:在人类急性白血病和正常人骨髓单个核细胞中发现一新的caspase-8异构体caspase-8s，编码DED1和部分DED2结构域，但是缺乏caspase结构域。Caspase-8s能够促进Fas抗体诱导的细胞凋亡，可能参与caspase蛋白酶级联反应的调节。此外，该实验还表明DED1而不是DED2可能是caspase-8与FADD相互作用的重要结构域。

目录

论文说明：缩略词表

声明

第一部分 TSC2基因在急性白血病中的异常表达

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 新的caspase-8异构体的克隆及其在细胞凋亡中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述一 TSC基因的生物学作用

综述二 Caspase-8与肿瘤的发生

攻读学位期间发表的文章题录

致谢